一、国内外食品（农产品）安全农药残留混合污染现状
近年来，我国农药的品种、产量及使用量剧增，特别是生产者在农业生产过程中混合施用多种农药的现象增多，造成农产品中出现多种农药残留。我国现有的农药残留最大限量标准仅规定单一农药残留的限量，而食品和农产品中常常存在多种农药残留共存于单一产品的混合污染，如蔬菜上可能残存多种农药形成“农药鸡尾酒”现象，导致无法对产品中混合污染物的联合毒性效应作出科学研判，给农产品质量安全和食物消费带来了风险隐患。
食品中农药残留联合效应风险评估成为近年来国际关注的焦点和研究热点。根据近年欧盟食品中农药残留风险监测结果，有超过26％的食品中含有多种农药残留，其中1/3的样品含有4种以上的农药残留，单个产品中最多含有8种农药残留。因此，消费者在食品消费过程中面临着多种农药残留同时暴露的风险。美国是最早通过立法关注多种农药残留累积性风险评估的国家，1996年颁布的《食品质量保护法》要求对食品、水及环境等途径中的多种农药残留开展风险评估。美国对有机磷类、氨基甲酸酯类、三嗪类和除虫菊酯类杀虫剂等农药进行了多残留风险研究，制定了多残留风险评估技术体系和框架，并用于指导农药残留限量标准的制修订。2000年以来，美国环境保护署（USEPA）发布了食品、饮用水等途径的有机磷类杀虫剂的累积性风险评估报告，指出了多种农药之间存在浓度相加的联合风险效应。欧盟法规（EC）396/2005规定在制定农药最大残留限量标准时应考虑多种农药残留的协同效应，并采用累积性风险评估方法开展多种农药的安全性评价。欧盟食品安全局（EFSA）2008年发布了开展食品中多种农药残留风险评估的科学意见，并用于指导农药最大残留限量值的制定。近年来EFSA发布了食品中有机磷类、氨基甲酸酯类杀虫剂、三唑类杀菌剂等农药残留累积性风险评估报告。
二、动物体内试验在农药残留混合污染联合效应评估中的应用
动物体内试验是毒理学的基本研究方法。传统的化学物毒性测试依赖整体动物，实验多采用哺乳动物，体内试验结果原则上可外推到人。因此，动物体内试验在混合污染联合效应评估中得到了广泛应用。Hass等利用大鼠体内试验研究了乙烯菌核利、氟他胺、腐霉利3种具有抗雄激素效应的农药对雄性大鼠生殖发育毒性的影响。研究发现，以肛门生殖器距离（AGD）作为毒性终点时，3种农药的联合作用基本符合剂量加和，而观察到的乳头保留（NR）结果略高于基于剂量加和的预测。将在单个农药作用条件下没有诱导AGD产生显著变化的剂量进行3种农药的混合，结果混合物能够产生AGD改变最高值一半的效果；在农药单独作用时只能产生NR效应很小的改变，而农药混合物能使雄性大鼠的乳头保留趋近雌性大鼠的性征。
代谢组学作为一种对生物体内所有代谢物进行定量分析，并寻找代谢物与生理病理变化的相对关系的新兴研究手段，可以全面地反映中毒后生物体内代谢物的变化，获得丰富的生物标志物信息，从一个新角度揭示毒性作用机制，因此在混合污染物安全性评估领域也得到了应用。中国科学院动物研究所伍一军团队利用代谢组学技术，重点针对有机磷类、氨基甲酸酯类、拟除虫菊酯类杀虫剂，研究了农药残留的联合毒性效应，发现马拉硫磷、抗蚜威分别与敌敌畏染毒后可影响小鼠肝脏的糖代谢、脂肪代谢和氨基酸代谢，并引起肝脏损伤；抗蚜威和敌敌畏等毒性复合染毒对肝脏功能相关代谢物的影响较两种农药单独作用时显著；马拉硫磷与敌敌畏复合染毒对肝脏功能相关代谢物的影响较马拉硫磷单独作用时相近；敌敌畏与抗蚜威、敌敌畏与马拉硫磷对肝脏的代谢功能的影响没有相互作用。
三、体外试验在农药残留混合污染联合效应评估中的应用
体外试验是利用游离器官、培养的细胞或细胞器进行毒理学研究，其中以细胞毒性测试技术为代表的实验动物替代方法的发展与应用已成为毒性测试的重要方向，获得越来越广泛的支持和管理认可，具有广阔的发展前景和重要的应用价值。法国国家食品安全、环境及劳动局（ANSES）对近年来法国果蔬消费中的农药残留及其混合污染物进行了监测，并利用人体细胞系对典型农药残留混合物进行了评估，对细胞活力进行了测定。研究了7组农药混合物对肝癌细胞系（HepG2）和结肠癌细胞系（Caco-2）的毒性，这7组混合物由2～6种农药组成，在蔬菜和水果监测中暴露水平较高。将测定结果同基于单一毒性和混合物联合毒性的预测结果进行比较，进而估计细胞毒性最强的两组组合。对于DDT和狄氏剂组合，等摩尔混合物的细胞毒性强于单一毒性和混合物联合毒性的预测结果。此外，等摩尔混合物导致的细胞凋亡率高于两者单独作用之和。因此，法国果蔬消费中的部分“农药鸡尾酒”组合产生了协同作用。此外，考虑到农药对孕烷X受体（PXR）的转录激活和目标基因（细胞色素CYP3A4）表达的影响，ANSES还对这7种“农药鸡尾酒”对细胞DNA的损伤、氧化应激、细胞凋亡和PXR核酸受体（细胞色素CYP3A4的转录调节因子，调节外源化学物质的代谢）的效应进行了研究，发现了具有细胞毒性效应的鸡尾酒组合，部分结果与浓度相加的预测结果产生了偏离。Christen等测定了有机磷类杀虫剂和吡咯类杀菌剂的联合抗雄性激素效应。在人乳腺癌细胞（MDA-kb2）模型中，无毒性效应浓度的各单剂和多种农药的混合物作用于细胞后，农药联合作用效果符合剂量相加作用，高浓度药物处理细胞时表现出协同作用，低浓度时为拮抗作用。吡咯类杀菌剂表现出了较强的抗雄性激素效应，符合相加作用和协同作用的比例各占一半。
四、生态毒理学方法在农药残留混合污染评估中的应用
在生态毒理学领域，通常利用鱼类、植物藻、大型溞等水生生物，或蚯蚓、线虫、发光细菌等生物对化学物进行毒理学评估。混合物的研究对象主要是从特定类型的化学物中选择，而针对具有不同作用机制或不同类型化学物的组分组成的复杂混合物的研究则较为少见。Faust以植物藻为模式生物，开展了16种化合物混合物的研究，所有化合物都与藻类的不同靶器官作用。当这些化合物以6.6％～66％的NOECs剂量混合时，可观测到18％的联合效应。Zhang等以毒物对青海弧菌Q67发光抑制为毒性指标，考察了马拉硫磷、甲基对硫磷、杀螟硫磷等6种有机磷杀虫剂的联合效应，该方法具有灵敏度高、相关性好、反应速度快等优点。结果发现二元混合物大多服从相加作用。中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所钱永忠研究员带领的科技创新团队以毒死蜱、丁草胺、高效氯氟氰菊酯等不同种类农药残留组成的混合污染物为研究对象，利用酶活力、急性毒性等毒性终点测定了二元、三元及多元农药残留混合物的联合毒性效应。二元混合物整体表现出浓度相加的联合作用特点，也有部分组合偏离了浓度相加或独立作用，但偏离系数一般在2以内；三元农药残留混合物在不同浓度水平呈现不同的联合毒性效应，并随急性毒性的增加而增强；多元农药残留混合污染呈现出显著的协同作用，并随混合物复杂性的增加而增强。一方面，混合污染物的联合毒性效应由各组分的毒性作用机制决定，但是这些组分作用于环境中的非靶标生物时，其作用机制可能改变并变得未知。另一方面，联合毒性效应还受到毒性效应水平的影响，导致联合作用方式在不同效应水平下变得复杂，而不再与各组分的作用机制有明显的相关性。此外，针对不同物种开展的同一混合物的毒理学测定可能会表现出不同的反应，并随着混合物组分的复杂性增加，联合效应趋向于显著的协同作用。研究结果表明，农药残留混合污染物的联合毒性效应广泛存在，仅考虑单一物质的毒性效应容易低估真实的风险水平，可为农药残留联合毒性效应评价及混合污染风险评估提供基础数据和科学依据。
五、混合污染物联合毒性效应判定研究进展
混合物毒理学的主要内容是根据各个组分的毒性信息来定量预测混合物毒性，前提是假设各组分之间没有相互作用。浓度（剂量）相加（ConcentrationAddition，CA）和独立作用（Independent Addition，IA）是最为常用的两种混合物联合毒性判定方法。
（一）浓度（剂量）相加
CA的理论基础是混合物的各组分作用机制相同，组分之间互为稀释物。如果这些物质的作用位点是同一个分子靶标，则一种组分可用等效应的另一种组分来代替，而不会改变混合物的毒性。CA模型的计算方程为：ECx，mix 表示诱导x％效应时混合物的浓度，ECx，i代表其中的组分i单独作用达到x％效应的浓度，pi是指组分i在混合物中相应的质量比例。
根据这种假设，将等毒性的物质浓度进行简单相加，即可得出混合物的毒性。该方法成功地预测了多种农药的联合毒性效应。
Altenburger研究了137种由不同农药组成的二元混合物，得出CA在观测毒性数据的整体预测性更好的结论。Faust也得出了类似的结论，即尽管所有混合物都是由除草剂和杀虫剂或除真菌剂组成，38个二元农药混合物中66％的组合可使用CA预测。Deneer重新评估了202个农药混合物的实验结果，发现在90％以上的情况下，CA可以准确评估混合物的联合毒性，且偏差不超过2倍。Warne认为75％～80％重新评估的混合物可使用CA准确评估，但其余20％～25％则存在偏差。只有5％的混合物使用CA评估的结果与实验观测结果有2.5倍的偏差，仅有1％的实验结果与CA预测值偏差超过5倍。
（二）独立作用
IA利用混合物中各组分的单一效应来计算联合毒性，根据统计学上独立事件发生的概率得出联合效应。单一组分在低于效应水平时，将不会对联合效应产生贡献。如果所有的组分都低于效应水平，则联合效应为零。IA模型的计算方程为：c mix和E(c mix) 分别表示混合药物的总浓度和总效应。E（c i）代表其中的组分i在混合药物中的浓度为c i时的效应。
在同一个研究中同时采用两种方法的报道中，在大部分情况下，IA方法预测的混合物效应中浓度（如EC50值）通常比用CA方法的结果高数倍，后者显得更为保守。Belden在2007年发表的大样本研究中包括了37个应用IA预测联合效应的实验，预测与观测的混合物毒性比率通过模型偏差率（MDR）表达。IA方法在预测具有不同作用机制农药的混合物时，其结果更为准确，但在大多数情形下与CA方法的预测结果相差很小。根据独立作用原理，100种能够单独产生1％效应的化学物质的联合效应值为63％；如果这100种化合物的单独效应为0.1％，联合效应值为9.5％。但是当混合物的组分过多时，对于各组分零效应和低效应对应剂量水平的准确区分非常困难。
六、农药残留混合污染联合效应评估研究展望
EFSA目前已经完成的评估主要侧重于同一个类别或者具有相同作用机制的化合物（如有机磷类、氨基甲酸酯类杀虫剂和三唑类杀菌剂），不考虑组分之间的相互作用，也称累积性风险评估。食物消费过程中的农药残留可以是不同类别组分的混合物，因此这些情况还不足以反映农药残留的真实状况。2013年之前，EFSA的植物保护产品及残留（PPR）科学小组发布过3份相关的科学意见。2008年，PPR科学小组迈出了累积性风险评估的第一步，起草了针对现有累积性风险评估方法实用性和可行性的科学意见，提出了根据农药结构、作用机制及毒性效应，将食品中各种农药划分到累积性评估组（CAG）的准则，认为具有共同作用机制的农药可利用剂量相加方法预测其累积性效应。随后，PPR小组根据食品中三唑类杀菌剂的典型案例，对2008年提出的累积性风险评估方法进行了验证，发布了食品中三唑类杀菌剂累积性风险评估的科学意见。为了继续完善食品和饲料中农药残留限量设定过程中的累积性风险评估，2013年该小组进一步提出了如何根据农药的毒理学资料建立CAG评估组的详细方法与准则。该科学意见认为，食品中的各种具有不同作用机制农药，可能对同一靶器官产生共同的毒性效应，因此其累积性毒性效应可借助于CA方法进行初步预测，这一方法适用于农药MRL设定过程或者实际暴露情形下的累积性风险评估。PPR小组建议，今后应进一步优化CAG小组的划分准则，收集农药的毒理学登记资料，加强农药毒性作用途径研究。同时，收集农药在哺乳动物中的剂量－反应关系评估结果，进一步检验IA方法在哺乳动物测试系统中的适用性及其保守程度。
2007年美国国家研究院（NRC）发表了《21世纪毒性测试：远景与策略》报告。该报告为未来毒性测试的发展提供了策略，未来的毒性测试的重点将由整体动物试验转向基于人类细胞、细胞系和/或细胞组分等实验动物替代方法的测试策略。毒性测试的主要内容包括化学物的特性分析、含毒性通路和靶向测试的毒性测试以及剂量－反应与外推模型的研究，通过这些研究进一步开展外源性化合物的危险度评价和人群暴露分析。毒性测试的重点关注因素包括敏感检测终点的选择与评价、细胞－反应网络、高通量与中通量方法的构建与应用、作用机制与作用模式、毒性通路以及系统生物学效应等，着力实施高通量、高灵敏度、低成本、预测能力强而且准确的毒性测试策略。因此，未来的毒性预测将主要依赖于体外试验和基于计算机模型，传统动物试验将可能被部分替代甚至完全替代。
随着体外毒性测定技术的发展，美国环保署（EPA）、国立卫生研究院（NIH）等机构合作，迅速启动了一个重大研究计划——21世纪毒理学计划（TOX21）。TOX21借助高通量的自动化机器人设备，通过一系列的毒性通路，研究环境中的复杂化学物对人体细胞的影响。TOX21的目标是研究、建立、验证新兴的测试方法来发现毒性通路，确定需要进一步评价的化学物的优先序。同时，该计划着力于寻找、发现化学物的毒性作用机制，来表征毒性通路的效应，促进物种间差异和向低剂量水平的外推，建立人类生物学效应的评价工具。目前，该计划的第一阶段高通量测试已经完成，包括11000种化学物。涉及的毒性测试终点包括细胞凋亡、细胞活力、DNA损伤、线粒体毒性、核酸受体效应，以及各种通路效应等。该计划的其他要素还包括利用斑马鱼、线虫等模式生物和3D体外细胞系（皮肤、肺、肾脏）作为测试对象的补充，并借助于生物信息学手段对测试结果进行分析。TOX21的评估结果将作为今后化学物毒性优先评价的重要依据。
作者：钱永忠，系中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所研究员；陈晨，系中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所助理研究员。
