国家三类新兽药——猪繁殖与呼吸综合征病毒ELISA抗体检测试剂盒

国家三类新兽药——

猪繁殖与呼吸综合征病毒ELISA抗体检测试剂盒

王绍关  董晓辉  徐高原

武汉科前生物股份有限公司

2014年11月13日，猪繁殖与呼吸综合征病毒ELISA抗体检测试剂盒获得农业部审批，被批准为三类新兽药，证书号为：【（2014）新兽药证字41号】。本试剂盒由华中农业大学、武汉科前生物股份有限公司共同研制。本刊特邀请该试剂盒的研制单位之一——武汉科前生物股份有限公司对本产品的研发、特点及临床应用作一介绍，为试剂盒在临床上的应用提供依据。

一、研发背景

1.立项目的及意义

猪繁殖与呼吸综合征（PRRS），也称蓝耳病，是以母猪繁殖障碍和其它各年龄猪的呼吸道症状及仔猪的高死亡率为特征的一种病毒性疾病。该病广泛流行于世界各国及地区，给养猪业造成了巨大的经济损失。据国内部分地区的调查研究显示，蓝耳抗体阳性率平均达到65%，个别地区高达90%。在加强预防免疫的同时，使用特异、敏感、快速、便于操作的检测试剂盒进行抗体监测，是有效预防和控制猪蓝耳病的前提。

作为国内第一家具有兽用诊断制品GMP车间的研制单位，武汉科前生物股份有限公司，致力于猪病检测技术的开发与应用。猪繁殖与呼吸综合征病毒ELISA抗体检测试剂盒，由华中农业大学、武汉科前生物股份有限公司联合攻关，已通过临床试验和产品复核，并成功获得该试剂盒新兽药注册证书，为猪场蓝耳抗体监测提供了快速、准确的检测工具。

2.研制历程

2002年，华中农业大学农业微生物学国家重点实验室利用分子生物学技术从临床分离毒株中克隆了PRRSV ORF7 基因，构建了含ORF7基因的重组大肠杆菌BL21/N，从而为试剂盒的开发打下了基础。

2004年，公司与华中农业大学联合对猪繁殖与呼吸综合征病毒ELISA抗体检测试剂盒进行了试制研究。

2005年，公司对试剂盒的抗原提取工艺，试剂盒的敏感性、特异性及相关生产工艺做了进一步优化。

2009年，公司将试剂盒整体系统进一步优化。

2012年，申报并完成临床试验（受理号：0702000579、批件号201141）。

2014年，武汉科前生物股份有限公司联合华中农业大学申报该试剂盒新兽药注册证书。于2014年11月获得农业部批准，【证号：（2014）新兽药证字41号】。

二、新兽药名称及主要组分

通 用 名：猪繁殖与呼吸综合征病毒ELISA抗体检测试剂盒。

主要组分：本试剂盒系由重组大肠杆菌表达的猪繁殖与呼吸综合征病毒N蛋白包被的抗原包被板、阳性对照血清、阴性对照血清、羊抗猪酶标二抗、样品稀释液、20倍浓缩洗涤液、底物液A、底物液B、终止液和血清稀释板等组成。

三、试剂盒的创新点和特点

采用PRRSV重组N蛋白作为靶抗原，N蛋白是PRRSV保守性最强的结构蛋白，在体液免疫中最早产生的抗体是抗N蛋白抗体，持续时间可长达300天；试剂盒敏感性达90%，特异性为100%，批间变异系数小于8%；能够检测到PRRSV活疫苗免疫后28天的血清抗体（建议蓝耳活疫苗免疫后30天左右采血检测）；能够检测到高致病性PRRSV抗体；操作简单，2-3个小时内即可出结果，样品处理量大。

四、检测原理

猪繁殖与呼吸综合征病毒N蛋白是保守性最强的结构蛋白。利用分子生物学技术从临床分离毒株中克隆了PRRSV ORF7 基因，构建了含ORF7基因的重组大肠杆菌BL21/N，将表达的产物纯化后作为包被抗原，制备成抗原包被板。检测时包被抗原将特异性结合N蛋白抗体，形成抗原抗体复合物，洗涤去除非特异性吸附的大分子物质，加入HRP标记的羊抗猪酶标二抗与抗原抗体复合物结合，再洗涤去除未结合的酶标二抗，最后加入底物，由HRP酶催化底物显色，通过底物显色深浅即可判定样品中N蛋白抗体的高低。

五、试剂盒质量的相关试验

1.特异性试验

用研制的猪繁殖与呼吸综合征病毒ELISA抗体检测试剂盒，检测猪伪狂犬病（PRV）、猪口蹄疫（FMDV）、猪瘟（CSFV）、猪水疱性口炎（VS）、猪圆环病毒Ⅱ型（PCV2）、猪乙型脑炎病（JEV）、猪细小（PPV）、衣原体、弓形虫病的阳性血清，检测结果全部为阴性（表1），可见试剂盒具有良好的特异性。

表1  我国主要猪病抗血清检测结果

注：KQ值大于等于20判定为PRRSV抗体阳性，KQ值小于20判定为PRRSV抗体阴性。

2.敏感性试验

将5份阳性参考血清倍比稀释后用猪繁殖与呼吸综合征病毒ELISA抗体检测试剂盒检测效价，同时与进口试剂盒检测结果作对比（表2）。结果显示两种试剂盒敏感性相当，说明研制的试剂盒有良好的敏感性。

表2  不同阳性参考血清效价测定结果

注：KQ值大于等于20判定为PRRSV抗体阳性，KQ值小于20判定为PRRSV抗体阴性。

3.符合率试验

用猪繁殖与呼吸综合征病毒ELISA抗体检测试剂盒检测200份血清，同时用进口试剂盒检测（表3），结果两种试剂盒均检测为阳性的血清为127份，均检测为阴性的血清为60份，总符合率为：(127+60)/200 = 93.5%。

表3. 符合率试验对比统计

六、临床应用

用猪繁殖与呼吸综合征病毒ELISA抗体检测试剂盒检测来自我国6个省的猪血清共计2340份（表4）。临床统计数据显示，我国各省猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体阳性率从53.0%-91.3%不等，大部分省份猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体阳性率在70%左右。

表4  来自不同地区的临床猪血清抗体阳性率

综上所述，该试剂盒具有很好的特异性和敏感性，与国外同类产品的符合率较高，适用于猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体的检测。试剂盒的成功研制，填补了国内具有自主知识产权的同类试剂盒只能依赖进口的空缺，为我国猪繁殖与呼吸综合征病毒净化提供了稳定可靠的抗体普查工具。