摘要本研究旨在检测仔猪免疫猪伪狂犬病活疫苗“喜可净”（Bartha K61 株）后，抵抗伪狂犬病病毒变异株攻击的保护效果。材料与方法：取4～6 周龄PRV 抗体阴性仔猪，肌肉注射接种配以A3 或RED稀释液的“喜可净”疫苗，一周后用猪伪狂犬病病毒变异株（AH02LA 株）进行攻毒。测定免疫后抗体阳转状况，检测攻毒后临床症状、直肠温度、鼻腔排毒和肺部病变。
实验结果：疫苗免疫组猪只（“喜可净”+A3 稀释液或“喜可净”+RED 稀释液）在免疫后7 天均可以检测到伪狂犬病病毒gB 的抗体。攻毒对照组猪只攻毒后3天出现体温持续升高，打喷嚏，鼻腔流出脓性分泌物，攻毒5天后出现呼吸困难，共济失调等症状，5～7天出现死亡，发病率为100 %，死亡率为60%，所有猪只鼻拭子均检出排毒，持续时间为1～5天，排毒量最高达103.875TCID50/0.1mL，所有猪只肺部均有出血、淤血等病变。两个免疫组的猪只攻毒后，所有猪只均未出现明显临床症状。“喜可净”+RED 稀释液组有4头猪只鼻拭子检测到排毒，其中2头仅持续1天，另2头持续3天，排毒的滴度均低于101.125TCID50/0.1mL。“喜可净”+A3 稀释液组仅有3 头猪只检出排毒，持续时间均未超过1 天，排毒滴度均低于100.25TCID50/0.1mL。所有免疫猪只肺部未见明显病变。
结论：使用猪伪狂犬病活疫苗“喜可净” 对仔猪一次免疫后7 天，能够快速产生免疫应答，可以抵御伪狂犬病病毒变异株攻击，尽管少部分猪只出现排毒，但持续时间缩短，排毒强度显著减弱；此外，“喜可净”配以A3 稀释液能提供更好的保护效果。猪伪狂犬病是由伪狂犬病病毒引起的一种急性传染病，母猪发生流产或产木乃伊、死胎和病弱仔猪，初生仔猪症状严重，主要表现呼吸系统和神经系统障碍，发病仔猪呼吸急促或呈腹式呼吸，出现肌肉震颤，步态失衡，后期肌肉痉挛，四肢麻痹，常见有病猪卧地后四肢呈划水状。通常情况下，随着日龄增大，症状有所减轻，断奶后的仔猪常不显症状或仅见轻微症状，成年猪大多为隐性感染。以前虽然有报道断奶后仔猪发生伪狂犬病出现发热和神经症状并死亡的病例，但多属个案，没有发生大规模流行。而2011 年以来，在我国的大部分地区爆发了一轮猪伪狂犬病疫情，此轮疫情与以住不同的突出特点是断奶仔猪的发病亦很严重，有时架子猪和育肥猪也出现典型呼吸道病症，疫情过后许多曾经的伪狂犬病病毒阴性的猪场重新变为阳性场，对我国养猪业造成了严重的损失。对此轮疫情的研究发现，一种毒力显著增强且传染力也很强的流行毒株的出现是主要原因，流行株的主要保护性抗原基因gB、gC 和gD 基因与以前报道的毒株相比发生了基因的插入或缺失以及点突变，是一种变异株，被划分为基因II 型谱系。对此次突发疫情的调查分析发现，此前我国许多猪场因成功实施伪狂犬病净化计划而停止注射猪伪狂犬病疫苗，造成猪群的易感性强，是引起爆发流行的又一重要原因。在疫情发生后，规模化猪场加强了猪伪狂犬病疫苗的免疫，绝大部分猪场发病势头得到了有效遏制，但猪群的PRV gE 抗体阳性率居高不下，使人们对现有猪伪狂犬病疫苗能否保护猪只对变异株的感染产生怀疑，本研究应用猪伪狂犬病活疫苗“喜可净”（Bartha K61 株）免疫PRV 阴性仔猪，检测其能否抵抗伪狂犬病病毒变异株的攻击。
1 材料与方法1.1 材料1.1.1 试验材料猪伪狂犬病活疫苗“喜可净”（Bartha K61 株），西班牙海博莱生物大药厂生产，产品批次为66HP。伪狂犬病病毒变异株AH02LA 株，F2，TCID50 是 10-7.25/0.1mL ，由国家兽用生物制品工程技术研究中心分离鉴定，制备批号为20141009，-70℃保存。疫苗稀释液：RED 稀释液和A3 稀释液均由西班牙海博莱生物大药厂生产，RED 稀释液批次为 025-14-2，A3 稀释液批次为09SM-1。检查伪狂犬病病毒抗体试剂盒由西班牙海博莱生物大药厂提供，PRV gE 抗体诊断试剂盒，批次为CAE.68YC，PRV gB 抗体诊断试剂盒批次为CAB.73VS。BHK-21 细胞来自中国兽医药品监查所（CL6），在本室传代扩繁。DMEM 和犊牛血清、胰酶购自Gibco公司。1.1.2 试验动物试验用4～6 周龄健康仔猪均来自散养农户，种猪或仔猪均未进行猪伪狂犬病疫苗接种，品种为二元或三元杂交猪，检测PRVgB 和gE 抗体均为阴性。
1.2 方法1.2.1 试验设计与分组试验中，选取PRV 抗体阴性仔猪20 头，随机分为4 组，每组5 头。A 组：用“喜可净”+A3 稀释液进行肌注免疫，每头猪注射1 头份，2ml/头份。B 组：用“喜可净”+RED 稀释液进行肌注免疫，每头猪注射1 头份，2ml/头份。C 组：攻毒对照，肌肉注射PBS，2ml/头。A、B 和C 组在免疫后7 天应用变异株（AH02LA株）攻毒。D 组：空白对照组，肌肉注射PBS，2ml/头，不攻毒（表1）。 1.2.2 攻毒方法与观测指标免疫后观察猪群的临床症状。在免疫前和免疫后 7 天两个时间点，采集试验猪只血清，通过阻断ELISA 实验检测伪狂犬病病毒gB 和gE 的抗体。A 组、B 组和C 组实验猪只免疫7 天后，通过鼻腔攻毒变异毒株AH02LA (攻毒剂量为107.1TCID50/mL, 2mL/dose)，攻毒后，每天检查每头猪只体温和临床症状，并且检测鼻腔排毒情况，鼻拭子样品的采集与病毒分离和滴度测定方法参考文献报道，主要步骤为取鼻拭子样品，置入含300U/mL 青霉素和300μg/mL 链霉素的PBS1mL 中，经充分震荡后，在-70℃冻融一次，10000RPM 离心10 分钟，取上清接种于BHK-21 细胞测定病毒的TCID50（Karber 法）。攻毒后14 天，剖杀所有猪只检查肺部病变情况。2 试验结果 免疫前，所有试验动物饮食、精神正常，无临床症状，没有检查到抗伪狂犬病病毒 gB 或gE 的抗体（表2）。试验整个过程中，空白对照组（D 组）所有猪只均临床表现正常（表3），无发热反应（图1），鼻拭子未检测到排毒（表4），试验结束剖检所有猪只肺部无明显病变（表5）。攻毒对照组（C 组）在攻毒前，所有猪只伪狂犬病病毒 gB 或gE 抗体均为阴性（表2），攻毒3 天后开始，所有猪只体温陆续升高到40.5℃以上，最长持续达7 天（图2 ）。对照组所有猪只出现精神沉郁，食欲减退，咳嗽，打喷嚏和流出化脓性鼻分泌物，攻毒5 天后猪群出现呼吸困难，共济失调，惊厥，在攻毒后第5天和第6 天分别死亡2 头和1 头，存活下来的仔猪生长缓慢（表3）。所有猪只在攻毒后第2 天或第3 天均能从鼻拭子检出排毒，持续时间3～5 天，排毒量最高达103.875TCID50/0.1mL（表4）。病死猪只或攻毒后14 天剖杀猪只的肺部均可见有明显的出血或淤血病变（表5）。“喜可净”+RED 稀释液组（B 组）和“喜可净”+A3 稀释液组（A 组）在接种疫苗后7 天，所有猪只伪狂犬病病毒 gB 抗体均为阳性，gE 抗体均为阴性（表2）。攻毒后所有猪只均未见有明显的临床症状（表3）, 无体温升高（图1）。“喜可净”+RED 稀释液组（B 组）有4 头猪只鼻拭子检测到排毒，其中2 头仅持续1天，另2 头持续3 天，排毒的滴度均低于101.125TCID50/0.1mL（表4）。“喜可净”+A3 稀释液组（A 组）仅有3 头猪只检出排毒，持续时间均未超过1 天，排毒滴度均低于100.25TCID50/0.1mL，降低的幅度更加明显（表4）。试验结束剖检所有猪只肺部无明显病变（表5）。与攻毒对照组（C 组）相比，“喜可净”+A3 稀释液组（A 组）“喜可净”+RED 稀释液组（B 组）的排毒持续时间大幅缩短，排毒量显著降低（图2）。3.结论与讨论病毒在人工或自然传代的过程中发生基因序列的变异是一种自然现象，疱疹病毒是DNA 病毒，相对而言，其发生变异的概率较低，尽管有时在免疫压力下，经过一定时间后会出现流行株毒力增强的情况，例如鸡马立克氏病病毒，其流行野毒株的毒力不断增强，但其血清型并没有发生改变，疫苗仍能提供足够的保护力。2011 年以来在我国流行的猪伪狂犬病疫情已被证实是由一种变异株引起的，变异株对猪的致病力和在猪只之间的传播力明显增强，对其基因序列分析表明，其与经典的PRV 毒株差异明显，可以归为一种新的基因型，即基因II 型，而经典株归为基因I 型，但其血清型没有发生显著改变，提示经典株的疫苗仍能对变异株产生有效保护。本研究用海博莱猪伪狂犬病活疫苗“喜可净”免疫没有伪狂犬母源抗体的仔猪一周后，再用致死量PRV 变异株（AH02LA 株）强毒来攻毒，结果表明两组免疫组猪只对攻毒仍有完全的临床保护，没有体温升高，没有临床症状。而仇华吉课题组（2014）报道， Bartha K61 株免疫一周后攻毒时3 头猪有2 头观察到有发热，精神不振和减食等症状，疫苗对仔猪的临床保护是不完全的。这些差异可能是疫苗生产所用的Bartha K61 株的培养条件不同，疫苗所用的稀释液不同，疫苗抗原含量不同等引起。此试验结果证明了Bartha K61 株对变异株的临床保护能力，也为2011 年以来田间生产反复观察到的紧急免疫依然有效，阳性场在Bartha K61 株的控制下无临床症状等现象提供了实验依据。A3 稀释液是一种含有免疫增强剂左旋咪唑和树脂等的新型稀释液，左旋咪唑和树脂被广泛使用在新型疫苗的佐剂中，能够更快、更强地激发机产生体液免疫和细胞免疫。本试验结果表明，相对于对照组，喜可净免疫组在攻毒后2 周内，仔猪排毒持续时间和排毒的量都显著降低；且A3 比RED 稀释液更胜一筹。在田间情况下，如此少量的短期排毒，对多次免疫的猪群，能否有效感染还待进一步试验。此试验结果提示Bartha K61 株对变异株造成的伪狂犬阳性场再次转阴提供了可能，也为2011 年以来田间生产反复观察到的阳性场在Bartha K61 株控制下再次转阴提供了实验依据。
此外，本试验也重复观察到了《猪病学》等文献对伪狂犬疫苗的一惯性描述，即伪狂犬疫苗不能彻底阻止感染猪只排毒，所以，净化猪伪狂犬病，还需要同时从其他方面进行配合。众所周知，在传染病的防控中，清除传染源、切断传播途径和保护易感动物是关键的三要素。本次试验和大量田间数据表明，现有疫苗仍能很好地保护易感动物。但是，阳性猪群不做淘汰，构成猪场的永久的传染源；一点式和连续生产的传统饲养模式无法有效切断伪狂犬病病毒的传播途径，这些都是造成目前阳性场转阴困难或者阴性场突然转阳的重要原因。
值得注意的一点是，自2011 年的伪狂犬流行到目前为止，各省阳性场率差别较大，发病早的区域仍然是阳性场居多，转阴难度大；有些区域的阴性场仔猪免疫一次（甚至一次不免）也能保持阴性，而有些区域的阴性场仔猪免疫2 次或者更多仍不免转阳；这些现象提示各猪场内和各地区野毒感染压力的不同。其实，判断一个场是否是真正阴性场，是否能长期保持阴性，除了做好生物安全，优化生产流程，合理接种疫苗，还要同时看该场所在区域是否是阴性区域。毋庸置疑，启动区域性净化，降低一个地区的伪狂犬病病毒感染压力对于降低各场净化难度，保持长期阴性是非常重要。反之，面对新的疫情，如果我们依然只是采取规模猪场进行本场内部的伪狂犬净化，或者只是对种猪场进行净化，而对商品猪以不发病为目标，我们的净化成果是很难有保障的。正如欧美多国猪伪狂犬病净化经验表明，疫苗的使用只是其中一个环节，启动区域性净化，对商品猪和种猪同时净化，才是伪狂犬净化正确的方向。（完）
