摘 要：采用PCR方法对上海及周边地区散养临床发病猪进行主要病毒病的病原学检测，主要包括猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病病毒和猪圆环病毒2型。2005年检测病死猪病料97份，4种病的阳性率分别为33.33%、23.81%、35.90%、40.00%；2006年检测357份，4种病的阳性率分别为15.91%、33.33%、10.53%、23.61%；2007年检测1 050份，4种病的阳性率分别为13.92%、35.20%、7.78%、20.57%。2005年－2007年的病例中均有不同程度的混合感染，混合感染率分别为3.09%、4.48%、3.62%，表明这些病原在上海及周边地区的散养猪中普遍存在，成为猪病防疫中不可忽视的一个环节。
关键词：病毒病；病原检测；猪
近年来，猪病的发病情况日趋严重，病原较复杂，发病率和病死率均有所上升，就病毒性疾病而言，仍然以猪瘟(Clssical swine fever，CSF)、猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respirafory syndrome，PRRS)、猪伪狂犬病(Pseudorabies，PR)和猪圆环病毒2型感染发生较普遍[1]。多重感染或混合感染仍然普遍存在，致使病情加剧，病死率升高，给防疫工作增加困难，给养猪户和养猪业造成巨大经济损失[24]。本研究针对2005年－2007年上海及周边地区散养户和小型专业户送检的猪病门诊病例，将临床疑似病料用PCR或荧光RTPCR方法进行病原学检测，以摸清4种疫病在上海及周边地区的整体流行状况，为更好地做好预防和控制工作提供技术依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 病料 来自2005年－2007年上海及周边地区散养户和小型专业户送检的病死猪，经本中心门诊剖检采集的内脏样品。
1.1.2 主要试剂 猪瘟病毒(CFSV)和荧光RTPCR检测试剂盒、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)荧光RTPCR检测试剂盒分别购自深圳太太基因工程有限公司和香港基因晶片开发有限公司；PCRKit购自宝生物工程(大连)有限公司。
1.1.3 PCR引物 猪伪狂犬病病毒(PRV)引物参考中华人民共和国猪伪狂犬病病诊断技术标准(GB/T18641－2002)，预扩增目的片段长度为217 bp[5]；猪圆环病毒2型(PCV2)引物参照芦银华等[2]根据PCV2的序列设计合成，P1：5′CCG CGG GCT GGC TGA ACT T3′；P2：5′ACC CCC GCC ACC GCT ACC3′，预扩增目的片段长度为1 154 bp，引物均由上海鼎安生物科技公司合成。
1.2 方法
1.2.1 临床诊断及病料取材 对送检门诊的发病猪通过询问了解饲养、防疫情况、发病病程和临床症状等，并观察病猪的外观病变；通过剖检各脏器的病变情况，采集病死猪的心、肝、脾、肺、肾、扁桃体和淋巴结等组织，对内脏组织，特别是有明显病变的内脏器管的病变部与健康部交界处组织进行可疑疫病的病原学检测。
1.2.2 病料处理 将每个病例的不同脏器分别剪碎、研磨、PBS匀浆，7 500 r/min离心5 min，取上清用于核酸的提取。
1.2.3 PCR或荧光RTPCR检测 猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒的检测参照试剂盒说明进行；猪伪狂犬病毒的检测参考中华人民共和国猪伪狂犬病病诊断技术标准(GB/T18641－2002)进行；猪圆环病毒2型参照芦银华[5]介绍的PCR方法进行。
2 结果
2.1 临床诊断结果
经询问和调查发现，大部分散养户是在临时搭建的简陋棚舍内或小屋内饲养几十至上百头猪，猪舍内外环境相对较差，卫生条件落后，营养状况参差不齐，防疫设施不全或没有，发病率一般为23%～49%，病死率为20%～50%，病猪一般精神沉郁，采食量下降或无食欲，体温大部分升高，且易反复，特别是在2006年和2007年的5月～9月，发烧严重，病死猪明显增加，此外有的出现神经症状、呕吐、呼吸困难、大便干燥、小便发黄、消瘦、营养不良，母猪流产或产木乃伊胎。
病死猪大体剖检病变为呼吸道充血、出血、喉头溃疡、间质性肺炎，消化道出血、水肿、胃底溃疡，腹股沟、肠系膜淋巴结等全身大部分淋巴结肿大、出血或坏死，脾边缘梗死、肾表面有白色坏死点，泌尿生殖道也有出血，脑膜充血、水肿等。根据临床症状及病例剖检，初步判定为疑似猪瘟、猪伪狂犬病、猪圆环病毒感染和猪繁殖与呼吸综合征。
2.2 PCR检测结果
2005年共检测97份临床疑似感染CFSV、PRRSV、PRV和PCV2病料，4种疫病检测数分别为27份、21份、39份、10份，阳性率分别为33.33%、23.81%、35.90%、40.00%，阳性病例主要集中出现在6、7月份(表1)。
表1 2005年临床发病猪病料的PCR检测结果
Table 1 Results ofPCR detection of clinic materialsinswine in 2005
病原 Pathogeny | 样品数/份 Sample number | 阳性数/份 Positive number | 阳性率/% Positive rate | 分布月份(病例数) Distributing month(case number) |
CSFV | 27 | 9 | 33.33 | 6(2)、7(7) |
PRRSV | 21 | 5 | 23.81 | 4(1)、5(1)、6(1)、12(2) |
PRV | 39 | 14 | 35.90 | 3(2)、4(3)、6(4)、7(4)、8(1) |
PCV2 | 10 | 4 | 40.00 | 1(1)、5(1)、7(2) |
合计 | 97 | 32 | 32.99 | 1(1)、3(2)、4(4)、5(2)、6(7)、7(13)、8(1)、12(2) |
2006年和2007年分别检测357份和1 050份临床疑似病料，4种疫病每个月几乎都有阳性病料被检出，没有明显季节性。2006年和2007年分别检测的样品数、阳性数和阳性率见表2。
表2 2006年和2007年临床发病猪病料的PCR检测结果
Table 2 Results ofPCR detection of clinic materials inswine in 2006 and 2007
病原 Pathogeny | 2006年 Year of 2006 | 2007年 Year of 2007 | |||||
样品数/份 Sample number | 阳性数/份 Positive number | 阳性率/% Positive rate | 样品数/份 Sample number | 阳性数/份 Positive number | 阳性率/% Positive rate | ||
CSFV | 88 | 14 | 15.91 | 158 | 22 | 13.92 | |
PRRSV | 102 | 34 | 33.33 | 572 | 201 | 35.20 | |
PRV | 95 | 10 | 10.53 | 180 | 14 | 7.78 | |
PCV2 | 72 | 17 | 23.61 | 141 | 29 | 20.57 | |
合计 | 357 | 75 | 21.01 | 1 050 | 266 | 25.33 | |
此外，2005年－2007年均出现有混合感染病例，且均为二重感染，分别有3例、16例、38例，混合感染率分别为3.09%、4.48%、3.62%(表3)。
表3 CSFV、PRRSV、PRV和PCV2混合感染检测结果
Table 3 The results ofmixed infenctions with CSFV，PRRSV，PRV and PCV2
病原 Pathogeny | 2005年阳性数/份 Positive number in 2005 | 2006年阳性数/份 Positive number in 2006 | 2007年阳性数/份 Positive number in 2007 |
CSFV＋PRV | 2 | / | 3 |
CSFV＋PRRSV | / | 4 | 6 |
CSFV＋PCV2 | / | 2 | 5 |
PRRSV＋PRV | 1 | 3 | 8 |
PRRSV＋PCV2 | / | 7 | 16 |
混合感染率/% Mixed infection rate | 3.09 | 4.48 | 3.62 |
3 讨论
上海及周边地区猪散养户较多，养殖密度较高，卫生条件差、防疫意识淡薄，给疫病的流行提供了良好的条件，每年由疫病造成的损失仍居高不下，从2005年－2007年送本中心门诊进行PCR检测的病死猪数量逐年增加，2007年1 050例，是2005年的10倍多，显示上海及周边地区散养户猪的传染病发病有所抬头，病情趋于复杂，需进行实验室诊断后才能确诊。所以，应对散养户或小型专业户加强动物疫病防范意识和饲养知识的宣传，切实做好动物防疫工作，防止疫病扩散。
疫病的发生没有较明显的季节性，常年均有阳性病例。2005年阳性病例主要集中在6、7月份，共有20例，占全年阳性病例的62.5%；2006年无论是检测数量，还是阳性数量下半年都明显高于上半年，下半年检测数占全年的76.19%、阳性数量占全年的60%，阳性病例主要分布在7月～11月，共20例；2007年，阳性病例主要分布于3月～9月，共有206例，占全年阳性病例的77.44%。从3年的检测数和阳性病例分布显示，普遍集中在3月～11月，尤其是5月～10月，天气炎热，应激较强，应注意通风降温，并加强隔离消毒，有效防止疫病的发生。
多种疫病混和感染的现象逐年增多，给生猪养殖带来了很大损失，也增加了临床诊断的困难。从3年的病例显示，2006年混合感染数量是2005年的3倍，2007年是2006年的2倍，尽管如此，3年的混合感染率都在5%以内，与黄夏等[6]报道的广西规模化猪场病毒性疫病混合感染率相比要低得多；混合感染种类逐年增多，从2005年的2种上升到2007年的5种，但都为二重感染，没有检测到三重或四重感染；在混合感染中PRRSV与PCV2，PRRSV与PRV合并感染较普遍，其中以PCV2与PRRSV混合感染最为严重。上述调查结果与许立华等[7]、Pallares F J等[8]、Pogranichny R M等[9]的研究结果较为一致。
经对发病猪群的临床检查和病原学检测，发现2005年猪群病毒病发生较严重，阳性率都较高，尤其是圆环病毒感染和伪狂犬病。而2006年和2007年猪繁殖与呼吸综合征阳性率上升明显，其余3种疫病均呈下降趋势，特别是猪瘟和伪狂犬病下降明显，表明近年来通过科学、合理的疫苗免疫和综合防疫措施的落实，猪病得到一定的控制，但因猪繁殖与呼吸综合征病毒的特殊性和易发生变异，导致疫苗不能很好的保护猪只抵抗猪繁殖与呼吸综合征病毒的侵袭，所以近年来发病越来越严重，加上猪圆环病毒感染的流行，免疫抑制性疫病对养猪业的危害越趋严重，继发或混合感染大大增加了发病率和病死率，尤其是两种免疫抑制病的混合感染更是给猪病的预防和治疗加大了难度[10]。