摘要：应用HPLC法测定比较了普通粉碎和超微粉碎对黄连解毒汤中黄芩苷溶出量的影响。采用Nova-PakC18色谱柱(3.9mm×150mm)，以甲醇-重蒸水-磷酸（47：53：0.2 ）为流动相，流速1ml·min-1， UV检测波长为280nm。结果表明，超微粉碎可增加黄芩苷的溶出，在超声提取下超微细粉中黄芩苷含量比细粉提高32.51%；而在简化提取(开水冲搅)下，超微细粉中黄芩苷含量比细粉提高51.23%。超微粉碎未改变黄连解毒汤固有的药效学成分，可提高黄连解毒汤中黄芩苷溶出量。
关键词：黄连解毒汤；超微粉碎；HPLC；黄芩苷
中图分类号：S853.73+2
中药属于天然产物，与抗生素、化学合成药物和激素类药物相比，具有毒副作用小、不易残留、不污染环境、不易产生抗药性等特点，而且疗效肯定、加工方便。所以应用中药制剂来解决长期困扰畜牧业发展的药物残留问题无疑是一条很好的途径。就目前而言，中药制剂产品的研究和开发已取得一定的进展，并在一定的范围内对动物疫病的防治取得了较好的效果，但还存在着许多不足。在制作工艺上，绝大多数剂型以散剂和煎剂为主，新剂型不多，品种单调；生产设备简陋，加工手段粗放，使用普遍剂量偏大；有些品种的研制过程不够精密，有效成分不清，作用机理不明。另外中药制剂如饲料添加剂，由于剂量偏大，不但给生产和运输带来许多不便，而且影响动物适口性和采食量。要解决以上问题，提高中药制剂的科技含量，进行中药加工技术的研究是极为重要的。
超微粉碎技术是20世纪70年代发展起来的一项高新技术，能把原料加工成微米级的微粉[1]，国外已广泛应用于纺织、食品、医药，化妆品和航天航空等国民经济和军事的各个领域[2~4]。鉴于粉碎是中药加工中的基本技术，近年来，在中药加工业中已引入超微粉碎技术[5~8]。中药的超微粉碎，是指以打破中药材细胞为目的的粉碎作业。中药材细胞在完整无损的情况下，有效成分只有过细胞壁(膜)释放出来才能被利用；完整的细胞壁(膜)对有效成分的释放形成阻力，且这种阻力随着细胞团内细胞数量的增大而增大；对中药进行超微粉碎，可以使绝大多数细胞破壁，使细胞内的有效成分直接暴露于溶媒中，从而使有效成分的溶出和起效更加迅速、完全。
著名中药方剂黄连解毒汤出自唐·王焘<<外台秘要>>，由黄连、黄柏、黄芩、栀子四味中药组成。该方剂为清热解毒代表方，具有清热、泻火、解毒之功效，中医上用于主治三焦热盛证[6,7]。《中华人民共和国兽药典》（2000年版）中的黄连解毒散即源于本方。据研究，本方具有一定的抗菌、解毒、耐缺氧、抗自由基等作用。在兽医临床上，本方广泛应用于败血症、脓毒血症、痢疾、肺炎等各种急性炎症。对该方进行超微粉碎技术方面的研究，国内未见报道。我们已对中药方剂黄连解毒汤进行普通粉碎和超微粉碎后的形态学方面进行了比较观察，并利用扫描电镜、生物显微镜、激光粒度测定仪对普通粉和超细微粉进行了表征，结果发现超细微粉粉末颗粒大小均匀、均质度明显改善，绝大多数细胞破壁。为了进一步了解黄连解毒汤普通粉和超细微粉中有效成分溶出效果的不同，进行了本试验。现将超微粉碎技术对黄连解毒汤中黄芩苷溶出效果的影响报道如下。
1 仪器与试药
1.1 仪器
Waters高效液相色谱仪及Waters-2487 双波长UV检测器（Waters公司，美国），BS-210S 型电子天平（北京赛多利斯天平有限公司），KQ-3200DE型医用数控超声清洗器（昆山市超声仪器有限公司），BMF-6型倍力微粉机（济南倍力粉技术工程有限公司），FZ-102微型植物试样粉碎机（河北黄骅市齐家务科学仪器厂）
1.2药材
黄连解毒汤由黄连、黄柏、黄芩和栀子(购于福州市药材采购供应站)按规定比例混合而成。黄连解毒汤细粉由植物试样粉碎机粉碎，过65目筛。黄连解毒汤超微细粉由济南倍力粉技术工程有限公司采用超微粉碎技术制成。
1.3 试剂
黄芩苷对照品（购自中国药品生物制品检定所），甲醇（色谱纯），磷酸（分析纯），水为重蒸馏水。
2．方法和结果
2.1 色谱条件[9]
色谱柱采用Nova-Pak C18，3.9mm×150mm，柱温30℃；流动相为甲醇-重蒸水-磷酸（47：53：0.2 ），流速为1ml·min-1；UV检测波长280nm。
2.2对照品溶液的制备
取黄芩苷，精密称定，置50ml容量瓶中，加少量甲醇使溶解，用水稀释至刻度，摇匀，即得黄芩苷对照品溶液（0.058mg/ml）。
2.3 供试品溶液的制备
取黄连解毒汤细粉及微粉粉末约1克，精密称定，置三角烧瓶中，加45%甲醇30ml，超声提取1小时，滤过，滤液置100ml 量瓶中，用少量水分数次洗涤容器，洗液滤入同一量瓶中，用水稀释至刻度。精密量取续滤液10ml，置25ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，以0.22um滤膜过滤分别得供试样品1号和2号[9]。
另取黄连解毒汤细粉及微粉粉末约1g，精密称定，置于50ml烧杯中，用适量沸水冲搅，浸泡15min后滤入50ml容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，用0.22um滤膜过滤分别得供试样品3号和4号。
2.4 线性关系
精密吸取黄芩苷对照品溶液2，4，6，8，10ul依次进样，在前述色谱条件下测定峰面积，以对照品进样量（X）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标，回归得直线方程Y=207678X - 31156，r =0.999。结果表明，黄芩苷进样量在0.116~0.58ug峰面积积分值与其浓度呈良好的线性关系（图1）。
2.5 精密度试验
精密吸取对照品溶液10ul，连续进样5次，记录峰面积积分值，结果表明精密度良好,RSD为1.3%（n=5）。
2.6重现性试验
精密称取同一批样品 5份，按供试品溶液的制备方法处理后，分别进样10ul，用外标法计算黄芩苷含量，其RSD分别为0.6%、0.9%、1.8%和1.1%（n=5），表明该法重现性良好。
2.7 加样回收率试验
取已知含量的4种供试液各5份，分别精密加入黄芩苷对照品，按2.3 项下方法制成供试液，每次进样10ul，并测定其黄芩苷含量，结果（n=5）4种样品的平均回收率分别为94.93%、 97.14% 、95.17% 、94.00%；RSD分别为0.3% 、1.0%、1.3%、0.7%，表明该方法可行。
2.8 样品测定
精密吸取10ul 样品液进样，用外标法计算样品中黄芩苷含量（图2-5）。4种样品的测定结果见表1。
表1黄芩苷含量测定结果 (n=5)
Tab1 The content result of baicalin(n=5)
样品编号含量RSD/%
sample No.( content)/mg?g-1
116.180.6%
2 21.440.9%
39.371.8%
414.171.1%
注:供试样品处理见2.3项：供试品溶液的制备。
附：图1黄芩苷对照品色谱图
图2 黄连解毒汤细粉
色谱图(超声提取)图3 黄连解毒汤超细微粉色谱图(超声提取)
图4 黄连解毒汤细粉色谱图(简化提取) 图5 黄连解毒汤超细微粉色谱图(简化提取)
3. 讨论
中药经超微碎加工后，所得的超细微粉粒径范围一般为1-75um，平均≤15 um。根据物理学知识可知，中药粒径在此范围内的颗粒，其细化程度尚不涉及原子或分子结构层面上的影响，，不会发生明显的分子结构上的变化，这为中药药效的稳定提供了基本保证，既不影响中药属性、药效特征和功能主治。从试验结果的粉体HPLC图谱显示，在同一提取方法下，细粉和超细微粉在相同的保留时间有相同的吸收峰，仅在峰值有差别，没有新的峰出现。说明超细微粉没有新物质生成，传统中药固有的药效学基础物质没有发生质的变化。中药超微粉碎，较好地处理了中药研发过程中继承与创新的关系，即发挥了现代科学技术的优势，又秉承了传统中药治病保健的固有特性。
现代中药加工研究不少从中药中提取中药有效成分，试图使用中药提取物来解决传统剂型存在的缺点。中药提取物的应用，在减少制剂用量、有效使用药材及对中药活性成分的研究具有划时代的意义。但提取物的剂型也有重要的缺点。因为中药与中医理论一脉相承，中药以中医基础理论为指导，提取物的使用难以体现中医的特色。尤其在复方研究上，中医强调药物协同和全成分入药，这是中药复方发挥药效的前提和关键。在中药加工业上进行超微粉碎技术的研究，一方面可以使药材细胞破壁，提高药效，提高中药生物得用度，降低中药资源的浪费和消耗；另一方面，仍然保持中药的全成分入药，可以遵循中医学辨证论治和理法方药的用药原则。因此将这一高新技术引入中药制剂领域进行应用研究，具有十分重要的意义。
实验结果表明：经超声提取后，黄连解毒汤中的有效成分黄芩苷含量超细微粉约比细粉提高32.51℅（见表1）；而在简化提取(开水冲搅)下黄连解毒汤中的有效成分黄芩苷含量超细微粉比细粉提高51.23℅（见表1）。以上结果与文献[10]报道“细胞破壁后，细胞内有效成分充分暴露出来，药物的释放量会大幅度提高”是一致的。超声提取是一种先进的提取方法，方便且提取率高；但在简化提取(开水冲搅)下，超细微粉中的黄芩苷含量仅略低于细粉在超声提取中的含量，故药材经超微粉碎后，细胞破壁，药物的有效成分不经细胞壁交换而被溶提出来，即可简便提取方法，又能缩短提取时间，中药超微粉的应用将会大大方便用药者。黄连解毒汤中含有的其它有效成分，如小檗碱、栀子苷等，它们是否与黄芩苷呈相关变化；以及黄连解毒汤两种粉体的药效学比较等将有待进一步研究和报道。
参考文献：
李凤生。超细粉体技术。北京：国防工业出版社，1999，1.
KONDO N, IWAO T, KIKUCHI M, et al. Pharmacokinetics of micronized, poorly water-soluble drug HO-221 in experimental animal. Biol Pharm Bull, 1993 16(8):796-800.
L.S.FAN. A stochastic model for particle disintegration –I grinds mechanism . Chmical Engineering Science,1981,36:1091-1096.
FARINHA A, BICA A, TAVARES P. Improved bio-availability of a micronized Megestrol acetate tablet formulation in humans. Drug DevInd Pharm,2000,26(5):567-570.
王爱武，吕文海。超微粉碎在中药生产中应用概况及展望。时珍国医国药，2000，11(7)：669.
骆苏芳，翁加丰。浅谈超微细中药粉体。中药材，1999，22(4)：209-211.
黄一帆，李富文，朱志雄。超微粉碎技术在中药制剂生产上的应用研究及展望。山东中兽医，2002，4：41-43.
吕文海，邱福军，王作明。炮制与超微粉碎对水蛭药效影响的初步实验研究。中国中药杂志，2001，26(4)：241-243.
沈嘉，吴秋媚。HPLC法比较不同工艺制备的黄连解毒汤及日本汉方黄连解毒汤中芩苷含量。中草药，1999，30(2)：102~104。
何煜，郭琪，杜晓敏. 中药细胞级微粉碎对体内吸收的影响. 中成药，1999，21(11)：601~602.