（一）酶标抗体法
免疫酶标抗体技术是一种综合定性、定位和定量；形态、机能和代谢密切结合为一体的研究和检测技术。在原位检测出病原的同时，还能观察到组织病变与该病原的关系，确认受染细胞类型，从而有助于了解疾病的发病机理和病理过程。
1 、 基本原理
酶标抗体技术是通过共价键将酶连接在抗体上，制成酶标抗体，再借酶对底物的特异催化作用，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，于普通显微镜或电镜下进行细胞表面及细胞内各种抗原成分的定位，根据酶标记的部位可将其分为直接法（一步法）、间接法（二步法）、桥联法（多步法）等，用于标记的抗体可以是用免疫动物制备的多克隆抗体或特异性单克隆抗体，最好是特异性强的高效价的单克隆抗体。直接法是将酶直接标记在第一抗体上，间接法是将酶标记在第二抗体上，检测组织细胞内的特定抗原物质。目前通常选用免疫酶组化间接染色法。
（ 1 ）标记酶
Stemberger （ 1986 ）指出，用于标记的酶应具备以下几点：
① 酶催化的底物必须是特异的，且容易被显示，所形成的产物易于光镜或电镜下观察；
② 所形成的终产物沉淀必须稳定，即终产物不能从酶活性部位向周围组织弥散，影响组织学定位；
③ 较易获得的酶分子，最好有商品出售；
④ 中性 pH 时，酶应稳定，酶标记抗体后，保存 1-2 年活性不应改变，且酶的催化活性（ Turnover ）越高越好；
⑤ 酶标过程中，酶与抗体连接，不能影响二者的活性；
⑥ 被检测组织中，不应存在与标记酶相同的内源性酶或类似物质。
其中，（ 1 、 2 ）两点最重要，因为容易显示的酶并非均能形成不可溶性的复合物。一般认为，辣根过氧化物酶（ Horseradish oeroxidase ， HRP ）较佳，是最常用的一种酶。
除 HRP 外，碱性磷酸酶（ Alkaline phasphotase ， ALP ）和葡萄糖氧化酶（ Glucose oxidase ， GOD ）也较常用。
（ 2 ）底物显色剂
① DAB （ 3,3- 二氨基联苯胺）：显色后阳性反应产物呈棕褐色；
② AEC （ 3, 氨基 -9- 乙基卡巴唑）：显色后阳性反应产物呈红色或紫红色。
下面以 PRRSV 为例介绍一下染色程序。
2 、PRRSV 染色程序 ：
（ 1 ）切片准备：将低温保存的切片 37 ℃预热 5min 。
（ 2 ）常规脱蜡：（二甲苯 15min ；二甲苯 15min ； 100% 乙醇 5min ； 100% 乙醇 1min ； 90% 乙醇 1min ； 75% 乙醇 1min ）
（ 3 ）抑制内源酶： 1% 盐酸酒精（ 75% 乙醇 99mL 加 1mL 盐酸）作用 10min ； 3% 过氧化氢水溶液 15min 。
（ 4 ）蒸馏水洗 2 次。
（ 5 ）用 0.05% 胰酶 37 ℃ 消化 2min 。
（ 6 ） PBS 洗 2 次， 擦干周围后用组化笔沿切片周边画一个圈 。
（ 7 ）封闭：正常马血清 1 : 20X 稀释， 37 ℃ 20min 。
（ 8 ）加一抗（ PRRSV Mab 15A1 1 : 800X 稀释）， 37 ℃ 1h 或 37 ℃ 0.5h 后 4 ℃过夜。对照片省去一抗。
（ 9 ） PBS 洗 3 次。
（ 10 ）加二抗（ HRP 标记的羊抗鼠 IgG 1 : 100X 稀释） 37 ℃ 1h 。
（ 11 ） PBS 洗 3 次。
（ 12 ）加 AEC 显色 5~10min 。
（ 13 ）苏木素衬染 10sec 。
（ 14 ）自来水洗 2min 。
（ 15 ）则待切片自然干燥后用水溶性封片剂封片。
（ 16）镜检、观察记录结果。
（二） 葡萄球菌蛋白 A （ SPA ）法
葡萄球菌蛋白 A （ Staphylococal Protein A ， SPA ）是一种从金黄色葡萄球菌细胞壁分离的蛋白质。早在 1940 年， Vevwey 发现在某些金黄色葡萄球菌中，含有一种物质，在双向扩散试验中能与正常人血清形成沉淀。 Jensen （ 1959 ）也发现类似现象，并将其命名为 A 抗原。直到 1963 年 Lofkvist 等分离了该抗原，并证明它是一种蛋白质。为与多糖相区别， Grov （ 1960 ）将其命名为葡萄球菌蛋白 A ，简称 SPA 或蛋白（ protein A ）。由于 SPA 的一些免疫学特性，它已经引起广大免疫学者的兴趣，并发展成为免疫学上一种极为有用的工具。
1 、 基本原理
SPA 具有和人及多种动物如豚鼠、兔、猪、犬、小鼠、猴等 IgG 结合的能力，可解决不同动物检测时，需分别标记相对应的二抗的问题。 SPA 结合部位是 Fc 段，这种结合不会影响抗体的活性。 SPA 具有的结合力是双价的，每个 SPA 分子可以同时结合两个 IgG 分子，也可一方面同 IgG 相结合，一方面与标记物如荧光素、过氧化物酶、胶体金和铁蛋白等相结合。但需注意的是， SPA 对 IgG 免疫球蛋白亚型的结合有选择性，如 SPA 与人 IgG 亚型： IgG 1 、 IgG 2 和 IgG 4 有结合力，唯独不结合 IgG 3 。只结合 IgA 2 ，而不结合 IgA 1 。 SPA 与禽类血清 IgG 不结合。因此应注意可能出现的假阴性结果。 SPA 常用 HRP 标记。可应用于间接法。
2 、 染色程序
染色程序基本同酶标抗体法，仅二抗改用 SPA-HRP 。
（三） 免疫组化染色结果的判定
1 、对照的设立
设立对照的目的在于证明和肯定阳性结果的特异性，排除非特异性疑问。主要是针对第一抗体对照，常用的对照有。
（ 1 ）阳性对照 用已知抗原阳性的切片与待检标本同时进行免疫细胞化学染色，对照切片应呈阳性结果，称为阳性对照。证明整个染色程序符合要求，尤其当待检标本呈阴性结果时，阳性对照就更加重要。
（ 2 ）阴性对照 用确证不含已知抗原的标本作对照，应呈阴性结果，另外空白、替代、吸收和抑制试验均为阴性对照。当阴性对照成立时，才能判定检测结果，主要用于排除假阳性。
对免疫组化染色结果的判断应持科学的慎重态度，要准确判断阳性和阴性，排除假阳性和假阴性结果，必须严格对照实验，对新发现的阳性结果，除有对照试验结果之外，应进行多次重复试验，最好用几种其他方法进行验证，如用 SP 法阳性，可再用 ABC 法、 PCR 等验证。必须学会判断特异性染色和非特异性染色，对初学者更为重要，否则会得出不科学的结论。特异性染色与非特异性染色的鉴别点主要在于特异性反应产物常分布于特定的部位，如细胞质、细胞核和细胞表面，即具有结构性。特异性染色表现为在同一切片上呈现不同程度的阳性染色结果，非特异性染色表现为无一定的分布规律，常为某一部位成片的均匀着色，细胞和周围的结缔组织均无区别的着色，或结缔组织呈现很强的染色，非特异性染色常出现在干燥切片的边缘，有刀痕或组织折叠的部位。在过大的组织块，中心固定不良也会导致非特异性染色，有时可见非特异性染色和特异性染色同时存在，由于过强的非特异性染色背景不但影响对特异性染色结果的观察记录，而且令人对其特异性结果产生怀疑。
2 、 阳性细胞的染色特征
免疫组织化学的呈色深浅可反映抗原存在的数量，作为定性、定位和定量的依据。
（ 1 ）阳性细胞染色分布有三种类型： ① 细胞质； ② 细胞核； ③ 细胞膜表面。大部分抗原见于细胞质，可见于整个胞质或部分胞质。
（ 2 ）阳性细胞分布可分为散在、灶性和弥漫性。
（ 3 ）由于细胞内抗原含量不同，所以染色强度不一。如果细胞之间染色强度相同，常提示其反应为非特异性。
（ 4 ）阳性染色定位于细胞，且阳性与阴性细胞相互交杂分布；而非特异性染色常不限于单个细胞，而是累及一片细胞。
（ 5 ）若仅在切片边缘、刀痕或皱折区域，坏死或挤压的细胞区，胶原结缔组织等部位呈现阳性反应，且表现为相同的阳性染色强度，不能判为阳性。
