EMX缓解6­MP对小鼠毒副作用的机理初探

摘　要：周龄的系小鼠只，分无处理的对照组、抗癌药物巯基嘌呤腹腔注射组组、＋倍稀释的饮水组饮水组、＋腹腔注射组注射组个组，每组只。试验期间定期进行体重测定。周后处死小鼠，测定胸腺脾脏系数、骨髓含量、肝脏组织过氧化脂质含量。结果表明，能引起脱毛、体重增加率下降、脾脏系数下降、肝脏损伤等副作用，能有效抑制抗癌药物副作用，增强机体自身免疫的能力。关键词：巯基嘌呤；副作用；有效微生物发酵抽取液；小鼠

20世纪90年代及21世纪初我国每年死于癌症的人数为150万，居各类死因之首。近几年死亡人数持续上升，成为现代医学最大的课题。癌症的治疗主要有手术疗法、化学疗法(抗肿瘤药物)、放射疗法和免疫疗法4种。癌症的化疗和放疗是通过阻碍细胞分裂和蛋白质的合成损伤癌细胞，但对正常的细胞也带来损伤，而且在治疗过程中会引起恶心、呕吐、体重下降、脱发、血液毒性、脏器损伤、免疫机能下降和二次癌变等副作用，成为癌症治疗中难以克服的问题^[1]。近年来，中药及制剂在抗肿瘤机理方面的研究也有了一些进展。尹龙等^[2]研究表明，某些中药多糖能激活T、B淋巴细胞、巨噬细胞、自然杀伤细胞等免疫细胞，增强机体免疫功能，提高小鼠脾脏T细胞增殖功能和血清抗体水平。有效微生物发酵抽取液(effectivemicroorganismextract，EMX)是将米糠、木瓜、海带及多种日本冲绳特有的保健药草，经过有用微生物的发酵培养，提取出抗氧化物质的复合物，具有很强的抗氧化能力，在农业、食品加工和建筑等行业已被广泛使用。由于能大幅度提高自身免疫力，作为辅助治疗手段也已用于现代医学难以治愈的疾病方面^[3]。

6­巯基嘌呤(6­Mercaptopurine,6­MP)是核酸代谢颉颃剂，在急性淋巴性、急性粒性及慢性粒性白血病治疗中经常使用。但因能阻碍细胞代谢，所以会引起肝、肾损伤和抑制免疫的副作用。

本试验通过抗癌药物6­MP对小鼠几项生理指标的影响及EMX的缓解效果，探讨EMX缓解6­MP治疗副作用的部分机理。

1　材料与方法

试剂及其仪器EMX由株式会社EM研究机构提供，批号010505,500mL装；UV­9100型分光光度计由美国BECKMAN公司制。

试验用动物5周龄的DDY系小鼠由日本琉球大学医学部动物室提供。

试验分组将40只DDY系小鼠，分无处理的对照组、6­MP 25mg/kg/周分两次腹腔注射组(6­MP组)、6­MP＋500倍稀释的EMX饮水组(6­MP＋EMX饮水组)、6­MP＋EMX0.1mL/2次/周腹腔注射组(6­MP，EMX注射组)4个组，每组10只。实验期间观察小鼠症状并定期进行体重测定。8周后处死小鼠，测定各项指标。

胸腺、脾脏系数测定取胸腺、脾脏测重(脏器重量mg/10 g体重)。

骨髓含量测定取出右侧大腿骨，剥除肌肉组织并切去两端关节，用10 mL 5 nmolC_aCI₂洗出骨髓，4 ℃冷藏30 min后2 500 r/min离心15 min，取除上清，沉淀物用5 mL 0.2N HCIO₂混合，90 ℃热水中加热15 min再用流水冷却至室温，过滤。在分光光度计波长268 nm处测定。

法测定肝脏组织过氧化脂质测定分别取1 g各试验组小鼠的肝脏，加9 mL 1.15%冷却的KCI溶液，用玻璃研磨器研碎，加0.3 mL1%的磷酸和1.0 mL TBA试剂，混合后90 ℃热水中加热45 min，立即用流水冷却至室温。加4 mL丁醇，振动后3 000r/min离心10 min，取除丁醇测定吸光度。波长选535 nm和520 nm 2处测定吸光度，利用吸光度差(A_535­520)计算出过氧化脂质含量^[4]。

统计分析用Kruskal wallis，Scheffe多重检验法统计。

2　结果

各试验组之间体重变化图1所示，各试验组之间体重变化没有差异。但与对照组相比，6­MP组、6­MP＋EMX饮水组、6­MP＋EMX注射组的体重增加率分别为57.62%、86.58%、80.54%,6­MP组的体重增加率最低。

图1　各试验组之间体重变化

Fig.1　Body weight changesamong experiment groups

胸腺、脾脏系数、骨髓含量和肝脏组织过氧化脂质的值表1表明，4个试验组的胸腺系数之间没有差异，但从数据上看，抗癌药物6­MP组的系数最低；脾脏系数6­MP组和对照组、EMX6­MP＋饮水组、EMX注射组差异显著(P＜0.01)。骨髓DNA含量6­MP＋EMX注射组的含量明显高于其他3组(P＜0.05）。肝脏TBA值各组之间没有显著差异。

表1　各试验组几项指标的测定结果

Table 1　Measure results of several indexes amongexperiment groups

注：不同字母表示各组间差异显著。

Note：Different letters represent significant difference amonggroups.

3　讨论

试验开始3周后，6­MP组的小鼠开始出现脱毛症状，8周后10只小鼠中7只出现CTCVersion2.0，grade1程度的脱毛症状。关于体重变化，各试验组之间虽然没有差异，但和对照组相比6­MP组的体重增加率仅为57.62%，说明化疗药物6­MP还是对体重增加有一定的影响。

胸腺和脾脏是机体重要的免疫器官，廉宜君等^[5]给小鼠灌服中药复合多糖，能显著提高小鼠免疫脏器指数，单核巨噬细胞系统的吞噬功能，可明显提高机体的免疫功能。胡兴昌等^[6]发现板蓝根凝集素对小鼠胸腺发育和胸腺细胞的增殖具有促进作用，这必然会导致T淋巴细胞和TEC所分泌的胸腺素和多种细胞因子的增加，提高机体的免疫能力。孟庆勇等^[7]利用马尾藻多糖，对辐射损伤小鼠巨噬细胞功能和胸腺的影响进行了研究，结果表明，马尾藻多糖增加了淋巴细胞的转化，对辐射的胸腺细胞起了保护作用。化疗药物的副作用之一是损伤免疫器官，使免疫机能下降。本试验中，经过化疗药物处理胸腺系数各试验组没有明显差异，但6­MP组的值偏低。脾脏作为血液储藏、造血、免疫抗体产生的脏器容易受化疗药物的影响，脾脏系数6­MP组和对照组、6­MP＋EMX饮水组、6­MP＋EMX注射组差异显著(P<0.01)。

DNA是生物体内的遗传物质，它的稳定对生命体正常繁殖和生长是至关重要的。环境中各种理化及生物因子等，都可能影响到DNA的稳定性。本试验中，骨髓DNA含量化疗药物6­MP组和对照组之间没有差异，但EMX处理组的含量高于对照组和6­MP组，特别是6­MP＋EMX注射组显著高于这两组(P<0.05)。这和脾脏系数的结果基本一致，一般在骨髓制造的免疫细胞和血细胞在脾脏中储藏，EMX有提高机体去除有害物质的能力，活化骨髓机能，减轻化疗药物对胸腺、脾脏、骨髓等的损伤，提高自身免疫能力。绞股蓝制剂可减轻模型组小鼠大脑和肝脏组织细胞DNA的损伤程度^[8]。同样，比嘉照夫等^[9]的研究中每日灌服EMX 10 mL和30 mL，连续灌服30d后，大鼠的骨髓DNA含量有增加的趋势，而且胸腺皮质层的厚度增加，脾脏细胞的淋巴细胞滤泡及淋巴滤泡中B细胞区的面积增加，T淋巴细胞和B淋巴细胞的数量增加。

脂质是机体重要的自由基攻击目标之一，其氧化生成物过氧化脂质的测定对肝脏功能的评定有重要的意义^[10]。多数化疗药物会引起肝功能的损害，肝肿大、黄疸，同时会诱发肝细胞坏死等。本试验中肝脏组织过氧化脂质各试验组间虽然没有显著差异，但3个试验组的TBA值高于对照组，说明6­MP对肝脏组织有一定的损伤。

EMX中含有许多植物类黄酮、皂角苷化合物、辅酶Q、维生素E族类物质^[9]，这些物质能调节许多酶的活性，皂角苷化合物能增加红细胞的SOD、LPO含量，抑制脑、肝脏组织的MDA，辅酶Q作为细胞生物氧化呼吸链中阳离子和电子的主要载体能改善和促进细胞代谢。以上各类物质的协同作用，加之各种微生物的代谢产物和生理活性物质，使机体的免疫功能增强。有研究发现^[11]，海参中的皂苷可提高小鼠胸腺体质量比，巨噬细胞对血液中碳粒的吞噬指数，提高体液、细胞免疫能力。GonamuM研究结果表明，EMX能显著提高NK细胞、B细胞、T细胞活性和巨噬细胞吞噬能力^[5]。EMX能提高鸡中性粒细胞对乳胶颗粒的吞噬活性和机体非特异性免疫功能^[12]。许多临床医生也报道EMX能明显提高癌症患者、糖尿病、特别是自身免疫缺陷病患者的免疫能力^[13]。所以，EMX作为癌症的辅助治疗手段，在世界各地广为应用。有关EMX在提高机体免疫能力的机理方面还有待于进一步研究。