摘要：中和抗体在抗猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染过程中起重要作用,被动输入PRRSV的中和抗体可预防PRRSV感染妊娠母猪，并且对母猪和仔猪都可起到消除性免疫作用。然而在自然感染PRRSV的过程中，这种中和抗体产生较晚,为病毒在宿主体内大量复制并感染其他易感动物提供了充裕的时间。PRRSV的主要中和位点位于糖蛋白GP5,核心区域称作B位点,GP5的另一个显性表位称作A位点,是非中和位点。A位点与B位点的同时出现将会抑制机体对B位点的免疫反应。当PRRSV发生中和位点突变时，产生无位点A的PRRSV，这种类型的PRRSV可诱导中和抗体的产生。文章通过对PRRSV的免疫反应、中和抗体的作用以及中和位点等三方面的阐述,综述了中和抗体在抗PRRSV感染过程中的作用。
关键词：中和抗体；猪繁殖与呼吸综合征病毒；疫苗
猪繁殖与呼吸综合征是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratorysyndrome virus,PRRSV)引起的一种严重危害养猪业的传染病［1］。该病于1987年在美国首次报道，1990年在德国也曾有报道，1990年-1991年冬季荷兰和比利时发生本病，并扩散到英国，1992年侵入到法国。加拿大和希腊也有发病的报告,英国和美国称它为猪“蓝耳病”。通过空气和猪的转移是本病的主要流行方式，健康猪与病猪接触、排泄物与分泌物污染的饲料等是本病传播的主要途径。临床表现为母猪繁殖障碍，呈现流产、死胎、木乃伊胎及弱仔等症状，仔猪及育成猪表现为呼吸系统症状。根据临床症状，基因和抗原性的不同，PRRSV可分为北美型和欧洲型分离株［2］。由于PRRSV具有抗原变异的特性，并且它的主要靶细胞是具有重要免疫作用的猪肺泡巨噬细胞(porcinealveolar macrophage,PAM)，因此，PRRSV的感染常引发其他病原的继发感染，尤其是呼吸道病原的感染，给养猪业造成重大经济损失。目前，亚洲的日本、韩国、菲律宾等国也有该病的报道。1996年哈尔滨兽医研究所在国内首次分离到PRRSV，证实本病在国内存在［3］。PRRSV属动脉炎病毒科(Arteriviridae)，该科还包括鼠乳酸脱氢酶增高症病毒(Lactatedehydrogenasee levating virus，LDV)、马动脉炎病毒(Equine arteritisvirus，EAV)、猴出血热病毒(Simian hemorrhagic fevervirus，SHFV)［4］。1992年OIE将PRRS列为Ｂ类动物疾病。该病毒粒子呈球形，直径约为48 nm～83nm，核衣壳直径约为25 nm～30nm，外绕脂质双层膜，含一个球形立体对称的、具有电子致密性的二十面体核衣壳；表面有明显突起；用氯仿或乙醚等脂溶剂处理可灭活病毒，证明该病毒粒子存在囊膜。在氯化铯中浮密度为1.19，在蔗糖中为1.14；该病毒不能凝集哺乳动物，如猪、羊、牛、鼠、马、兔、鸭、鸡和人O型红细胞；对热不稳定，在4℃以上逐渐失去感染性，56 ℃经15 min～20 min失活［2］。
PRRSV一个显著的生物学特性是对PAM的亲嗜性，PAM是首选增殖系统。虽然呼吸道的上皮细胞也可被感染，但在肺脏病毒滴度可达105TCID50/ｇ肺组织。尽管在脱落的肺泡样细胞和支气管上皮细胞也检测到PRRSV，但PAM占肺脏受感染细胞的80%～94%[4]。PRRSV的另一个重要生物学特性是抗体依赖性增强作用(antibodydependentenhancement，ADE)。所谓ADE是指在一定抗体的存在下可介导和加强感染［4］。在猪肺泡PAM培养物中加入一定滴度的PRRSV抗体，可使PRRSV产量提高10倍～100倍。用加有PRRSV抗体的病毒培养物接种妊娠中期母猪，可提高病毒在胎儿中的复制，且显著高于单纯接种病毒组。反映在临床上则是刚断乳的仔猪呼吸道疾病临床症状经常比较大的育成猪严重得多[5]。
1 感染免疫反应
有报道称，猪人工感染后早期一段时间内，许多病例出现临床症状和病毒在肺脏及其他组织的巨噬细胞中大量增殖的特征，然后出现组织高病毒含量和无细胞病毒血症，可持续一个月以上[6]。在感染晚期，PRRSV在特定位点持续低水平存在，主要存在于淋巴组织。病毒持续感染包括不间断的低水平的病毒复制，这个过程估计最少持续150d[7-8]。大多数青年猪感染实验表明，在病毒感染猪后2个月左右，是与其他动物接触传染最有效时期。尽管持续感染的真正机制还不清楚，但PRRSV之所以在恢复期动物体内持续存在，是因为宿主免疫体系不能建立有效的免疫保护作为主要致病因子的说法是合理的。因此，很多人认为免疫系统对猪抗PRRSV感染是无效的。猪感染PRRSV后约4周发生T细胞介导的反应，这种反应从感染后第9天到第14周[9]都可被检测到。在接毒后早期能检测到强抗体反应，开始于感染后7d～9d，这种血清反应可通过间接荧光抗体反应检测到[10]。然而，没有证据表明这种早期产生的抗体能够保护猪不受PRRSV感染，这种早期产生的抗体在体外不能中和PRRSV[11]。具有中和活性的PRRSV抗体只出现在感染后期[12]早期明显的PRRSV和抗PRRSV特异性抗体同时存在于循环体系中，说明早期产生的抗体没有能力保护机体不受PRRSV感染。感染早期血清中存在的PRRSV抗体能刺激PRRSV在巨噬细胞中的复制，不论是在体内还是在体外[12],因而早期产生的抗体似乎无保护作用，相反可能是有害的。猪感染PRRSV也会发生针对病毒的迟发型超敏反应，说明CD4辅助性细胞也被活化。衡量T细胞毒性的IFN-γ也由T细胞产生[9]，CD4+ T细胞的目标是膜蛋白(M蛋白)和GP5(glycoprotein Ⅴ，GP5)，然而CD4+T细胞的保护性反应和中和抗体的产生一样，发生较晚。
2 中和抗体的作用
由于在用PRRSV攻毒后中和抗体的产生较慢而且不规则，所以中和抗体在保护机体免受PRRSV感染中所起的作用是有限的[13-14]。然而有报告指出中和抗体可以防止病毒血症的发生；近年有人报道，病毒血症的清除与抗GP5的抗体的出现密切相关[13-14]；另外，免疫接种GP5和M蛋白可提供一定程度的保护，这种保护与中和抗体的出现密切相关[15]。一个标准的评估中和抗体保护作用的实验方法是在易感动物攻毒后人工被动输入单克隆或多克隆抗体。一些病例中和抗体的出现削弱了机体抗特定病毒的免疫反应，如猪繁殖与呼吸综合征病毒和人免疫缺陷病毒[16]；在另一些病例中，被动免疫可提供坚强的保护作用。中和抗体的重要性已在其他动脉炎病毒感染中得到证实，例如马动脉炎病毒感染，中和抗体调理起主要作用，可作为动脉炎病毒的样本；另外，中和抗体在血清中的出现和病毒清除是同步的[17]；被动输入中和抗体可降低EAV的复制并预防其感染。中和抗体主要是抗糖蛋白GL（GL是EAV的GP5中约含100个氨基酸的胞外结构域，EAV的主要中和表位在GL蛋白，定位在亲水性胞外结构域N端1/2部分，约有99个～106个氨基酸）[15]。免疫接种重组基因疫苗(大肠杆菌中表达的GL蛋白的18位～122位氨基酸),发现中和抗体水平与对动物的保护力呈正相关，确证了中和抗体在保护动物抗EAV感染的重要性[18-19]。LDV是另一个被深入研究的动脉炎病毒，这个病毒可引起鼠的无症状感染，抗LDV中和抗体输入小鼠体内可防止其感染LDV[20]。
许多报告指出中和抗体在抗PRRSV感染中起重要作用。有报告指出PRRSV自体灭活疫苗不能产生中和抗体，因而保护作用较弱；而弱毒疫苗可诱导产生抗体，因而有一定的保护作用[15]。尽管动物在感染PRRSV后或许细胞免疫和中和抗体在清除病毒过程中都起作用，但迄今为止证据只表明后者的重要性。另外，用PRRSVGP5接种免疫猪后可诱导产生中等水平的中和抗体，尽管如此，当用同种（或同源）毒株攻毒时，猪可被保护，仅表现轻微发热，用MARC-145细胞只能从肺和纵膈淋巴结回收到病毒，攻毒2周后，中和抗体滴度增加到128[18-19]。因此，免疫接种PRRSVGP5的DNA疫苗和PRRSV弱毒疫苗都能诱导产生中和抗体，都有一定保护作用。最近有人进行了血清输入实验，提供了确凿的证据证实单独使用中和抗体可以完全防止PRRSV感染妊娠母猪；另外，无论是仔猪还是母猪，被动输入的中和抗体可起消除性免疫的作用，可使感染猪用病毒分离法和RT-PCR法不能从淋巴器官检测到病毒；同样，中和抗体对幼猪也有保护作用，能够100%保护易感动物抗PRRSV病毒血症的最低抗体滴度是1∶8[10]。因此，无论是母猪还是仔猪，中和抗体在血清中的滴度与对猪抗PRRSV感染的免疫保护作用呈正相关。这些资料说明，通过被动输入中和抗体的方法可为处于易感染PRRSV的动物提供及时保护。已有人用通过DNA重组技术克隆中和抗体基因获得的高浓度的中和抗体被动输入动物体，可作为治疗方法[20]；也有人用PRSSV免疫接种母鸡，然后从纯化鸡胚中的高滴度的中和抗体被动输入动物体，使动物体处于中和抗体保护状态，同时也可清除动物体内的病毒[21]。
3 中和位点
众所周知，PRRSV的主要中和位点位于GP5蛋白[22-23]，另一个中和位点在M蛋白。GP5蛋白胞外结构域氨基端高度糖基化，并与M蛋白形成异原二聚体[22-23]，用反向免疫法和其他涉及重叠蛋白的研究确证GP5主要中和位点与中和抗体的活动相关，这个位点的最小抗原区域在33位～47位氨基酸，已被确认是中和表位的核心区域[24]。这个核心区域被称做B位点，B位点可被单克隆抗体所识别，并且可诱导产生我们已用于上述被动免疫试验的抗体[25]。另外，WissinkE证实中和单克隆抗体可识别欧洲株的胞外域N端,PlagmaP用恢复期动物血清发现，中和位点在欧洲株和美洲株都存在。两种病毒中和位点定位与上述B位点定位相同，所有结果证实GP5胞外域对PRRSV起重要的生物学作用。
GP5的另一个显性表位被称作A位点。在PRRSV感染后表位A迅速诱导非中和抗体产生。A位点的核心部分在GP5蛋白的第7位氨基酸，在B位点上游，GP5的氨基端[24]。它的特征与Decoy表位功能相似。Decoy位点是那些导致与中和位点免疫反应性降低的毗邻于中和位点的位点，例如,在人免疫缺陷病毒（Humanimmunodeficiency virus，HIV）的GP41蛋白[25]。HIV的糖蛋白41(GP41)蛋白的中和位点（ERDRD位点）对兔有免疫原性，然而当位点ERDRD多肽与非中和位点(IEEE位点)并列存在时，ERDRD位点对兔的免疫原性消失了。无中和活性的IEEE位点与位点ERDRD相距约两个氨基酸，因此，可推测是非中和位点降低了中和位点的免疫原性。用含位点ERERD而无IEEE位点多肽免疫接种小鼠，可使获得的血清中抗ERDRD位点的抗体浓度在0.1μg/mL~0.2 μg/mL[26]。
已被深入研究的LDV的中和位点位于VP-3P(LDV的主要糖蛋白)的37位~44位氨基酸之间，这是LDV惟一的中和位点，代表VP-3P的合成多肽可被中和单克隆抗体识别，这个合成多肽可用于ELISA检测血清中的中和抗体[16]。然而，针对这段多肽的抗体不能中和LDV，说明这段多肽不是最优化构象[22]。与PRRSV的GP5表位相似的多肽通过半光氨酸定位于碳端，作为人造多肽用于免疫接种小鼠或猪，尽管动物能产生针对这段多肽的抗体，但所产生的抗体不能中和PRRSV[12]。因此，和LDV一样，PRRSV的中和位点确实能被中和抗体所识别，但不能诱导中和抗体的产生，提示还有其他残基对诱导中和抗体产生起决定作用。
中和位点的突变被称作抗原漂移，是RNA病毒免疫逃逸的主要机制。然而，有的病例中和位点定位于具有强致病力的糖蛋白，这些病例中，突变发生在这些特殊位点对病毒不利，PRRSV正是如此。因此，其他非常规的感染机制对PRRSV逃避免疫监视并在宿主体内持续存在起重要作用。抗位点A的抗体在PRRSV感染早期被诱导产生，而在感染后前30d不能检测到抗B位点的抗体[27-28]。因此，认为A位点与中和B位点的同时出现将抑制对中和位点B的反应。抗中和位点B的抗体的延迟产生可以解释早期研究者所描述的无中和抗体产生的原因，因此，中和抗体延缓产生是PRRSV逃逸免疫监视的主要机制，也是PRRSV感染的主要特征。很多研究表明GP5前导区存在断裂位点，用不同的预测方法，一些研究者推定GP5前导区断裂位点在31位~32位氨基酸之间[27-28]，而另一些研究者认为在25位~26位氨基酸之间[20]。因此，有人推定很可能在感染后期PRRSV的变异是由糖基化和非常规的GP5多肽的断裂引起的，由于在31位~32位氨基酸断裂造成无位点A，PRRSV含这种类型的分子形式会诱导低水平的抗位点B的免疫反应。因此，在持续感染阶段所产生的抗体对清除病毒是无效的，当PRRSV发生突变，致使A位点消失，B位点被识别，诱导中和抗体产生，并最终清除病毒。例如，据最新报道，亲神经性PRRSV毒株在GP5的44位氨基酸有N-S突变，这将缺失这个位置的糖基化。这个突变与LDV的N-S突变相似，使这个毒株有亲神经性同时使其更易被中和。
在PRRSV攻毒后发生急性冗长的感染，以病毒血症为特征，大约持续30d，此期间无抗B位点的中和抗体产生，PRRSV开始以非常规的机制逃避免疫监视。例如，在感染后诱导低水平的α-IFN以降低危险信号（一般能诱导强烈特异性细胞反应）水平[9]，诱导多克隆扩张，以分散特异性抗体反应。另外，在攻毒感染后数周，抗GP5蛋白胞外域抗体处于免疫显性的核心位置，而不是A位点，很可能是A位点与胞外域的糖基化抑制了B淋巴细胞特异位点上的IgM识别B位点。当PRRSV发生抗原位点突变，A位点消失，诱导中和抗体产生。中和抗体和细胞免疫反应共同作用终止病毒感染细胞，并最终根除组织中的病毒。
4 展望
中和抗体在抗PRRSV感染过程中起重要作用，然而延迟诱导保护性细胞免疫和体液免疫,为病毒在宿主体内大量复制，并感染其他易感动物提供了一个时间窗口。在这个过程的晚期，中和抗体和细胞免疫同时被诱导，终止病毒感染细胞，并最终根除组织中的病毒。血清中和抗体水平与B位点特异性B淋巴细胞的克隆频率的增长正相关，再次感染PRRSV将活化这种克隆，并会诱导得更快、产生更多的中和抗体，这已在免疫接种动物攻毒试验中被证实。因此，理想的PRRS疫苗应该在短时间诱导高水平的中和抗体和特异性细胞免疫反应。