根据奶牛场隐性乳房炎的发病率情况，对广东省3个大型奶牛公司下属的奶牛场乳房炎奶样进行细菌的分离和鉴定，结果表明链球菌、葡萄球菌、大肠杆菌和枯草芽孢杆菌占的比例最高，高达82.4%。同时对获得的致病菌株进行药敏试验，采用恩诺沙星和丁胺卡那霉素联合用药，其治愈率达到100%。本文采用高效液相色谱法对牛奶中恩诺沙星及其代谢产物环丙沙星进行残留检测。
1 材料与方法
1.1 药物与试剂盐酸环丙沙星对照品：含量为99.8%，批号为H010598，中国兽医药品监察所；恩诺沙星对照品：含量为100%，批号为H051200，中国兽医药品监察所；柠檬酸，乙酸铵，三乙胺(均为分析纯，天津市化学试剂一厂)；乙腈(色谱纯，香港FisherScientific公司)；甲醇(分析纯，广州化学试剂厂)
1.2 仪器与设备高效液相色谱仪：产品号G1311A，系列号：DE14918471，配备四联泵、脱气泵、色谱工作站、荧光检测器、自动进样器和柱温箱，自动进样瓶，安捷伦科技有限公司生产；电子分析天平：AG204型，瑞士METTLERTOLEDO公司；离心机：EBA8S型，德国Hettich公司；微型混合器：MSI型，马来西亚IKA公司；多功能振荡器：HS250Basic型，德国IKA公司；可调微量移液器：德国〖CM)〗EPPENDORF公司。
1.3 试液的配制
1.3.1 环丙沙星和恩诺沙星标准溶液的配制 环丙沙星标准液：准确称取盐酸环丙沙星对照品0.0116 g，置于10ml棕色容量瓶中，以超纯水溶解，用甲醇定容至刻度，即成1mg/ml的环丙沙星标准贮备液。恩诺沙星标准液：准确称取恩诺沙星对照品0.0100 g，置于10ml棕色容量瓶中，以10%醋酸溶解，用甲醇定容至刻度，即成1 mg/ml的恩诺沙星标准贮备液。
1.3.2 流动相与提取液的配制流动相包括水相和有机相两部分，水相为柠檬酸乙酸铵缓冲液，有机相为乙腈。提取液为10%三氯乙酸甲醇溶液。
1.4 试验步骤
1.4.1 样品前处理过程 准确量取0.5 ml牛奶于2 ml离心管中，加入10μl环丙沙星和恩诺沙星标准工作液，旋涡混合器上混合60 s，静置30 min。加入0.49 ml提取液，旋涡混合器上混合60s以上，静置20 min。15 000 r/h离心10 min。吸取上清液，0.2μm微孔滤头过滤至棕色自动进样瓶中，上机检测。
1.4.2 色谱条件和工作指标 检测器：荧光检测器，激光波长278 nm，发射波长465 nm；色谱柱：HypersilBDSC18，5 μm，批号5/120/6706，大连依利特公司生产；流动相：水相/有机相=82/18；柱温：25℃；流速：1.0ml/min；进样：HP1100型自动进样器进样，进样量为30 μl。
2 结果
2.1 色谱图 在上述色谱条件下能将环丙沙星、恩诺沙星与乳汁中其他组分分离开,环丙沙星、恩诺沙星的保留时间依次为6.2 min和8.3min。乳样中各药物标准曲线回归方程及相关系数见表1。
2.2 乳中恩诺沙星、环丙沙星的回收率和变异系数恩诺沙星在乳汁中的平均绝对回收率为97.29%，批间和批内的平均变异系数分别为2.29、3.35%，环丙沙星在乳汁中的平均绝对回收率为97.27%，批间和批内的平均变异系数分别为2.62%、4.61%，结果见表2。
2．3 乳中恩诺沙星及代谢产物环丙沙星的浓度 见表3、4。
表1 乳样中各药物标准曲线回归方程及相关系数
药物 重复 线性范围（μg/ml） 标准曲线回归方程（n=5） 相关系数
环丙 1 0.01～2.00×10-3A+0.0206 0.9997
沙星 2 0.01～2.00×10-3A+0.0116 0.9995
3 0.01～2.00×10-3A+0.0148 0.9996
4 0.01～2.00×10-3 A+0.0076 0.9992
5 0.01～2.00×10-3A-0.0007 0.9975
恩诺 1 0.01～2.00×10-3A-0.0034 0.9985
沙星 2 0.01～2.00×10-3A-0.0022 0.9990
3 0.01～2.00×10-3A+0.0007 0.9986
4 0.01～2.00×10-3A+0.0104 0.9993
5 0.01～2.00×10-3A-0.0044 0.9979
3 讨论
3.1 检测方法 本试验采用高效液相色谱法检测恩诺沙星在牛奶中的残留，液相色谱条件是检测器为荧光检测器，激光波长278nm，发射波长465 nm；流动相：水相/有机相（84/16）；柱温为25℃；流速为1.0 ml/min；进样量为30μl。在此条件下，恩诺沙星及其代谢产物环丙沙星能完全分开，其保留时间依次为8.3 min和6.2 min。
本试验建立的检测方法具有灵敏度高、选择性良好、线性范围较宽（0.01～2.00μg/ml）、受外界条件影响较少等优点。恩诺沙星在乳汁中的平均绝对回收率为97.29%，批间和批内的平均变异系数分别为2.29%、3.35%；环丙沙星在乳汁中的平均绝对回收率为97.27%，批间和批内的平均变异系数分别为2.62%、4.61%；在牛奶中的检测限为10ng/ml。
3.2 恩诺沙星及其代谢产物环丙沙星在乳汁中的残留恩诺沙星消除半衰期较长，体内分布广泛，表观分布容积大，其代谢产物环丙沙星的形成需要一个过程。乳房内灌注药物可以使得患病乳房内维持较高的药物浓度，从而达到高效杀菌的目的。从检测到的各时间点乳中恩诺沙星和环丙沙星的乳药浓度来看，个体间差异较大，各乳区的炎症严重程度可影响到恩诺沙星的吸收和代谢，同时个体间乳汁分泌量也有较大差异，在炎症恢复过程中产奶量的增加情况也会有所不同，这些都可导致个体间乳药浓度的差异。
此外，两者乳药浓度下降的原因可能是由于治疗后乳腺功能得到恢复，产奶量大大增加；其次，随着时间的推移，乳腺分泌乳汁的量越来越多，从而乳药浓度越来越低。
3.3 奶牛灌注恩诺沙星后的弃乳期据欧盟规定恩诺沙星在动物食品组织中残留量为恩诺沙星及其代谢产物环丙沙星之和，其最大残留限量（MRT）为100ng/ml。本试验测得环内沙星在24 h的浓度低于0.03μg/ml，因此在此时间上加上1～2天的休药期，推算恩诺沙星在牛奶中的弃乳期为72 h。