毛细管电色谱（capillary electrochromatography， 简称CEC）是近年发展起来的一种高效、 快速的新型微柱分离方法。它在毛细管柱内填充液相色谱固定相或在柱壁键合固定相， 以电渗流驱动流动相， 溶质根据它们在固定相和流动相之间分配及其电泳淌度的不同而得以分离的一种电分离模式[1,2] 。CEC以具有塞子流型的电渗流代替了具有抛物线流型的压力流， 因而具有毛细管区带电泳(CZE)的高效性。 CEC采用液相色谱的固定相和流动相， 因而还具有高效液相色谱(HPLC)的高选择性。 由此可见， CEC既克服了CZE选择性差和分离中性化合物困难的弱点，又克服了胶束电动色谱 (MEKC)的胶束选择有限的缺点， 因此， 从1974年Pretorious等[3]第一次实现CEC分离以来，CEC已受到越来越广泛的关注，尤其是进入90年代以后，这一领域的论文呈指数增长[4] ，并于1997年8月在美国California召开了第一届毛细管电色谱会议。
根据固定相的存在形式， CEC可以分为填充毛细管电色谱（packed - column CEC， 简称PCCEC)和开管毛细管电色谱(open - tubular CEC， 简称OTCEC)。 PCCEC近年发展很快， 但要使PCCEC进一步从实验室走向应用， 还须解决三个难题： 一是焦耳热效应， 二是塞子效应， 三是气泡效应[1,5] 。 OTCEC一般采用10 μm左右毛细管柱， 散热很快， 焦耳热效应很小。 OTCEC中没有塞子， 因而没有塞子效应。 气泡产生于塞子与填料、 塞子与检测窗口的交界处， OTCEC中没有塞子和填料， 因而不易产生气泡， 即使产生气泡， 也可以用高压液体将气泡排出， 而对柱子没有任何损害。此外， OTCEC中没有填料， 因而没有涡流扩散， 能够获得比PCCEC更高的柱效； OTCEC中的电渗流流速比PCCEC中的大60％[6] ， 因此OTCEC更适于快速分析。 由此可见， OTCEC分析复杂混合物样品具有很大潜力。 对于PCCEC国内已有分析工作者进行这方面的研究[4,5,7,8] ， 但对于OTCEC尚未见报道， 为使国内色谱工作者尽快了解该领域的发展， 本文对OTCEC的发展、 柱制备、 理论进行了较为详细的综述。
1 历史回顾
1958年， Golay[9]首先将开管柱用于气相色谱中， 开管柱以高效、 快速的特点， 很快在气相色谱中占据了主导地位。 1969年， Knox等[ 10]首次进行了开管液相色谱（open - tubular liquid chromatography， 简称OTLC)实验。 此后， OTLC受到了广泛关注， 其优越性在理论和实验上都得到了验证。 由于OTLC要获得比填充色谱更高的柱效， 其内径必须小于5 μm[11,12] 。 在这么细的柱中制备一层相比大、 柱容量大、 稳定性好的固定相是非常困难的; 此外， 为了获得高柱效， 检测和进样体积必须小于10 pL[11,13] 。 在实践中一般采用柱上检测， 但由于光程太短， 需要使用不太普及的激光诱导荧光检测器； 对于进样， 则需要复杂的分流进样器, 因此OTLC尽管起步较早， 但一直发展不快。
1974年， Pretorious等[3]指出在毛细管中可以使用电渗流驱动流动相， 由于他采用的毛细管内径太大， 未能展示电色谱的优越性。 1982年， Tsuda等[14]进行了第一次开管毛细管电色谱， 验证了OTCEC的高分离能力。 Martin等[15, 16] 研究了开管电色谱的轴向扩展及峰展宽， 从理论上证实了用电渗流推动流动相的优越性。 1990年， Bruin等[17]在10 μm的石英毛细管中400 s内分离了8种PAHs ， 取得了很好的分离效果。 他们的研究发现OTCEC的电渗进样比OTLC使用进样阀进样更为简便、 准确，而且OTCEC可以使用比OTLC更大内径的毛细管， 从而减少了在开管柱的制备及检测方面的困难， 可以使用更为常见的紫外检测器。 从此，OTCEC才逐渐受到重视。 1995年， Guo和Colon[18,19]采用sol－gel技术制备OTCEC柱， 简化了制柱过程， 制得了高相比、 高柱容量的OTCEC柱， 在分离PAHs时， 柱效高达5×105/m。 进入1997年后， OTCEC的文献明显增多， 这也说明OTCEC日益受到重视。
2 基本理论
2.1 保留机理
CEC保留机理包括两个方面： 其一， 如同HPLC， 基于溶质在固定相和流动相间相互作用的不同；其二，如同CZE， 基于溶质电泳淌度的不同。 由于电泳机理的参与，在HPLC中使用的容量因子k′ 已不能正确描述CEC的迁移行为。 CEC的容量因子可用下式[20, 21] 表示：
(1)
该式中k.是CEC的容量因子， k′是在CEC中单纯由色谱因素引起的容量因子， μep为溶质的电泳淌度， μeof为流动相的电渗淌度。 值得注意的是， 在CEC中采用电场驱动， 它对溶质的色谱保留有显著的影响， 因此在(1)式中的色谱容量因子k′并不等同于HPLC中的 k′。 从(1)式可以看出， CEC的容量因子并非CZE的选择性因子和HPLC的容量因子的简单加和， 两者之间是相互影响的。 对于中性化合物， μep为零， k*等于 k′， 反映纯粹的色谱过程； 对于不保留的带电化合物， k′为零， 反映纯粹的电泳过程； 对于有保留的带电化合物，色谱和电泳机理同时起作用。 因此， CEC既能分离电中性物质， 又能分离带电物质， 因而对复杂的混合样品显示出了强大的分离潜力。
2.2 柱效评估
OTCEC和OTLC的柱效可以用Golay公式[9,15] 表示：
(2)
该式中u是流动相线速度， Dm 、 Ds分别为溶质在流动相和固定相扩散系数， Cm、Cs分别为固定相和流动相的传质阻力系数， dc为柱子的内径，df为固定相的厚度。 等式右侧第一项为轴向扩散项， 第二项为流动相传质阻力项，第三项为固定相传质阻力项。 在通常情况下， 固定相传质阻力项可以忽略不计[22]， 因此对塔板高度H的贡献主要来自第一项和第二项。 流型对Cm的影响很大， 电渗流的流型呈塞子状(EDF)， 其Cm可以用下式[15, 17]表示： (3)而压力流的流型呈抛物线型 (PDF)， 其Cm可以用下式[ 15,17] 表示：
(3)
而压力流的流型呈抛物线型(PDF),其Cm可以用下式[15,17]表示:
(4)
图1是根据(3)式和(4)式所作的与k′ 的关系曲线。 很明显， 这两个函数都随k′的增大而增大， 但始终比大。 在 k′ < 2时，比大得多， 当k′> 2时，只比大2倍, 因此， 在保留较小时， Cm对H的贡献OTCEC比OTLC小得多。 由此可见， OTCEC的高柱效主要是由于电渗流型呈塞子状， Cm较小， 有较小的流动相传质阻力。从OTCEC的文献报道来看， 2×105～3×105/m的柱效很常见， 最高柱效可达5×105/m， 其高效性可以与CZE相媲美， 而且克服了CZE不能分离中性化合物的缺点。 从(2)式可以看出毛细管的内径对柱效影响很大; 图2 是根据(2)式所作的H与dc的关系曲线， 从图中可以看出H随dc呈指数增长， 但OTLC比OTCEC增长得更快。 另外， 还可以看出10 μm的OTCEC柱获得的柱效与5 μm的OTLC相当， 这也就是说， OTCEC可以使用比OTLC更大内径的毛细管柱， 使得OTCEC在柱的制备及在柱检测方面显示出更大的优越性。 图3 是根据(2)式所作的H与u的关系曲线。 内径相同时， OTLC的H大约是OTCEC的两倍， 增大流速对OTCEC的影响比对OTLC的更小， 因此OTCEC在快速分离中有很大的应用前景。 特别值得指出的是， 在OTCEC中， 使用10 μm内径的柱子， 在u 大于最佳流速时， H几乎为常数， 这对于快速分离有实际意义。 Bruin等[ 17]采用10 μm的OTCEC柱400 s内基线分离了8种多环化合物。
图1 在压力驱动(PDF)和电驱动(EDF)下流动相传质阻力系数(Cm)与容量因子(k’)的关系
Fig1 Mass-transfer coefficient in mobile phase(Cm) versus retention factor(k’)plot for PDF and EDF
图2 在OTCEC和OTLC中理论塔板高度(H)与毛细管内径(dc)关系
Fig 2 Theoretical plate height(H)versus capillary ID(dc)plot for OTCEC and OTLCparameters:Dm=10-9m2/s;u=2mm/s
图3 在OTCEC和OTLC中理论塔板高度(H)与流动相的线速度(u)关系
Fig3 Theoretical plate height(H)versus linear velocity (u) polt for OTCEC and OTL
Cparameters:Dm=10-9m2/s;k’=1
3 OTCEC 柱的制备
内壁光滑的毛细管柱的相比， 是填充柱的1/350[12]， 因此开管柱制备的关键是增大表面积， 以制备相比大、 柱容量大的色谱柱。 从1969年开始， 对OTLC就有不少研究[10] 。 1982年Tsuda等[14]进行了第一次OTCEC实验， 但是由于柱制备的困难一直进展不大。 开管柱的制备方法主要有3种： 涂布聚合物固定相、 表面粗糙化后键合固定相、 溶胶－凝胶（sol－gel)技术。
3.1 涂布聚合物固定相
聚合物固定相， 由于稳定性好、 相比大、 柱容量大， 因而在OTLC中应用较广， 是目前制备OTLC的主要方法。 这种方法在OTCEC中也有应用[23～30] 。1990年Pfeffer等[23] 在10 μm的毛细管中采用聚合物固定相， 分离了5种PAHs， 获得了2.5×105～2.9×105/m的柱效。 Pfeffer和Garner[24]在毛细管管壁键合PS－264和OV－17， 在流动相中加入了离子对试剂， 分离了具有相似电泳淌度的物质。 Mayer等[ 25,27]和Armstrong等[29]在毛细管管壁涂布聚硅氧烷，并在其上键合手性环糊精分离了手性物质。 交联的聚合物固定相覆盖了柱壁表面的硅羟基， 不能产生足够的电渗流。 为了加大电渗流，需要加入表面活性剂如十六烷基三甲基溴化铵（CTAB ）等, 因而限制了聚合物固定相在OTCEC中的应用。近年Tan等[ 28] 在毛细管管壁键合线性聚合物， 使硅羟基能够部分露出， 以产生电渗流， 在5 min 内基线分离了4 种对羟基苯甲酸酯。 此外， 溶质在聚合物固定相中传质系数小,获得的柱效低， 也限制了这种方法的使用。
3.2 表面粗糙化后键合固定相
3.2.1 蚀刻毛细管柱 由于石英毛细管化学惰性强、 不易蚀刻， 早期的开管柱都采用易于蚀刻的钠玻璃或硼玻璃制备[31～34] 。其制柱过程是先对其表面进行蚀刻， 以增大表面积， 然后将固定相键合上去。 1982年，Tsuda等[14] 使用这种方法进行了第一次OTCEC实验。这种方法得到的相比太小， 钠玻璃或硼玻璃比较脆， 毛细管容易断， 因此没有得到推广。 最近， Pesek报道在300～400 ℃下用NH3HF2溶液蚀刻石英毛细管， 表面积可以增大1 000倍[35～37] 。
3.2.2 沉淀多孔硅胶 Tock等[38,39]发展了一种在10～25 μm毛细管管壁沉淀一层多孔硅胶的方法。 首先在毛细管中注入聚乙氧基硅烷，然后通入氨气或氨水使其沉淀出二氧化硅，析出的二氧化硅吸附在管壁上形成一层多孔硅胶。 1990年Bruin等[17] 将这种方法用于制备OTCEC柱。 在硅胶上键合ODS后， 用于分离PAHs， 获得了1.2～2.3 μm的塔板高度。 这种方法能够获得较大的相比和较高的柱效， 但是制备特别困难， 主要表现在经常堵塞柱子， 重现性不好， 不宜制备内径小于10 μm的柱子。
3.2.3 键合多孔硅胶 Crego等[11] 发展了一种在毛细管管壁键合一层多孔硅胶的方法。 四乙氧基硅烷、 乙醇、 盐酸或氨水以一定比例混合， 搅拌10 min ， 将该溶液注入毛细管中， 在80 ℃加热 6.5～8 h 后， 用氦气将其冲出。 四乙氧基硅烷在高温下水解产生原硅酸， 原硅酸缩聚产生硅凝胶。 经过活化的毛细管管壁有很多硅羟基， 这些硅羟基也参与缩聚反应， 从而将一薄层硅凝胶固定在管壁上， 剩余硅凝胶用氩气冲出。 这层凝胶通过干燥和老化形成多孔的硅胶， 在硅胶上键合固定相就制得了开管色谱柱。 Crego[11]用这种方法制备5 μm的ODS柱， 用于OTLC实验分离PAHs， 取得了5×105/m的柱效。 这种方法制得的柱子， 相比较大， 柱效较高， 稳定性好， 成功率在80％以上， 但是制柱的步骤多， 周期长。
3.3 溶胶－凝胶（sol－gel）技术
sol－gel技术在制备复合玻璃材料[40]、 生物化学传感器[41,42] 方面应用较广。 1995年， Guo和Colon[ 18,19]用sol－gel技术制备OTCEC柱， 分离PAHs， 柱效在2.8×105～5.0×105/m之间。 四乙氧基硅烷（TEOS）、 正辛基三乙氧基硅烷（C8－TEOS）、 乙醇、 盐酸和水按一定的比例搅拌一段时间， TEOS和C8－TEOS水解产生原硅酸， 原硅酸缩聚产生硅凝胶。 水解和缩聚同时进行， 但水解速度大于缩聚速度。 在水解结束后， 将凝胶注入活化的毛细管中， 缩聚反应继续进行，毛细管壁上的硅羟基也参与反应，从而将部分硅凝胶固定在管壁上；将剩余的凝胶用氮气冲出，固定在管壁上的凝胶通过干燥和老化形成一薄层带有固定相的多孔硅胶。 其基本原理与键合多孔硅胶相似， 但不需额外键合固定相，从而简化了制备过程。 由于固定相与硅胶是以C—Si键相连， 其化学稳定性较好， 在pH 0.3～11.4之间都可以使用[ 18]。 1997年， Colon等用sol－gel技术制得了以氟化物为固定相的毛细管色谱柱， 基线分离了6种苯的氟化物[ 43]。 用这种方法制得的柱子相比较大， 柱效较高， 制柱的成功率也高， 但必须加入带有固定相基团的三乙氧基硅烷， 因而其固定相的选择余地不大。
4 应用与展望
OTCEC作为一种新型的微柱分离方法， 具有高效、 快速的特点， 已经得到一定的应用。 Pfeffer和Yeung[ 24]在聚合物OTCEC柱中加入离子对试剂， 分离了5种具有相似电泳淌度的氨基萘磺酸异构体。 Mayer等[ 25,27]和Armstrong等[ 29]用β－CD键合的OTCEC柱分离了手性物质。 Schweitz等[ 30]利用分子印刻技术(Molecular Impriting)制备OTCEC柱， 实现了手性药物的快速分离， 仅用120 s基线分离了心得安(propranolol)手性异构体。Wu等[ 44]用sol－gel制得C8－OTCEC柱， 然后以氨基取代硅羟基， 用以产生电渗流和减少吸附， 在pH为3时分离了6种多肽， 取得了很好的分离效果。
但是， 目前OTCEC分离的物质还局限于小分子有机化合物， 主要是多环芳香烃化合物。 随着柱制备方法的不断改善， 具有不同选择性的固定相， 甚至蛋白质、抗体或抗原等具有特殊选择性的物质均有可能键合到毛细管管壁上， OTCEC能分离的化合物将越来越多。 OTLC和CZE由于质量检测限低， 柱效高，已成功的用于单细胞多组分的定量检测[ 45, 46]， 而OTCEC综合了两者的优点，它必将在生物领域中显示出广阔的应用前景。 OTCEC不需要填料，从而具有易于微型化的特点。1994年，Jacobson等在10 mm×10 mm的微片（micro chip)上进行了OTCEC的尝试[ 47]。 尽管柱效不高， 但这预示OTCEC在色谱仪器的微型化和集成化中具有广阔的发展前景。 目前， OTCEC尽管还没有得到广泛应用， 随着科技的发展， 在OTCEC中遇到的困难必将逐步得到解决， OTCEC将有望发展成为强有力的微量分离分析方法。