因为样品中经常会含有能够吸附在色谱柱固定相上的杂质化合物，所以应该经常对色谱柱进行清洗或冲洗。当色谱柱在多次进样后显示出柱效降低时，有必要采用适当的流动相对色谱柱进行处理，冲洗除去吸附在固定相上的污染物和样品残余物。
方法如下：
将色谱柱从系统上取下，反向连接到输液泵上。色谱柱出口不要连接到检测器上，以免污染检测器流动池。
大多数的硅胶基质色谱柱反相冲洗没有问题，但是聚合物基质色谱柱并不能如此操作，在反相冲洗色谱柱之前最后与色谱柱生产商确认，反向冲洗流动相流速不要太大。
冲洗溶剂的选择要考虑分析的样品和使用的流动相条件，一般清洗流动相强度应该比流动相更强，但是条件应该尽可能的温和。
A. 用适当的溶剂冲洗色谱柱的盐和强添加剂。
B. 用比分析流动相更强的溶剂冲洗，该溶剂与流动相组成相同但不含盐和酸。
C. 如果认为B布骤没能完全清洗干净色谱柱，用100％最强溶剂冲洗。
在清洗色谱柱时，最好用与流动相组成相同的溶剂，但是如果使用其他的溶剂，最重要的是要考虑到溶剂之间的互溶性，另外不要用强酸和强碱。
