摘要：作者开发了一种方法来比较各种C-18及C-8色谱柱，此方法是基于各种色谱柱对极性和非极性化合物的保留时间、对称性及选择性的差异。这个用于比较各种色谱柱的实验既反映了键合相的疏水性，又反映了硅烷基质的活性。作者收集了色谱柱的保留时间数据并列成图表，以供选择替换柱和后备柱时使用。
-18和C-8硅烷色谱柱是高效液相色谱（HPLC）中最常使用的色谱柱，而且，在美国市场上有多于100种C-18和C-8色谱柱出售。面对这么多可供选择的色谱柱，分析工作者很难从中选出适当的色谱柱来具体使用，同时更难选择出一根合适的替换柱。
对于非极性样品（如小分子芳烃）或弱极性样品（如对羟基苯甲酸酯），C-18和C-8色谱柱是最容易选择的。对于这类样品，色谱柱之间的主要差异在于保留因子（k）；而在选择性方面却只有微小的差异。但对于极性和中等极性样品色谱柱的选择却相当困难。例如含氨基或酸性基团的药物化合物。分析工作者会发现极性样品在保留时间、选择性和峰形都有很大的差别。
色谱柱的选择性和峰形受到担体硅胶的影响远大于键合相的影响。另外，有研究报道在反相色谱中表面硅烷醇、硅酸及金属杂质的影响。在特殊情况下，选择性的差异可由填料制备时使用的键合过程决定的。
通常情况下，色谱工作者选择HPLC色谱柱是通过比较由色谱柱供应商所提供的填料介质的规格来决定的。这些规格内容包括：表面积、末端封尾、含碳量、颗粒形状、颗粒尺寸、孔径、孔容积、装填密度和键合度。含碳量和键合度仅由色谱制造商提供，没有这些规格使用者不可能计算出碳的克数，也不可能计算出一根色谱柱中键合相的微分子数。分析工作者可使用这两个数据来估计一根色谱柱的疏水性质。然而，即使制造商提供所有上述规格数据，使用者也不可能精确地预测出色谱柱对含有极性官能团的化合物的选择性。
由于色谱的保留时间是基于分析物和填充基质之间许多微妙的相互作用，我们建议使用混合物测试来比较填充基质的规格与性能。Engelhardt 和他的同伴回顾了硅烷反相色谱的特性，并且提出用溶解物试验来描述固定相的疏水性和亲硅基醇特性。另外有一些人也改进了测试条件和方法来解释那些色谱数据，但他们只测试了很少的商品色谱柱，并且在他们的测试混合物中没有羧酸。在本文中，我们使用了一个含有羧酸的测试混合物来收集了86根C-18和C-8硅烷色谱柱（见表1）的数据。我们将测试结果详细描述如下。
表1：研究中所使用的色谱柱的生产商(略)
在我们的比较中，我们使用了含有6种物质的测试混合物，此6种物质列于图1。每一种物质在测试混合物中都起特殊的作用。尿嘧啶是用于产生空体积。甲苯是测试色谱柱的疏水性。吡啶和N，N-二甲基苯胺是用来测试硅醇基对碱性物质的活性的碱性胺类物质。苯酚是一种弱酸，用于与吡啶联合起来确定活性担体硅的数量。4-正丁基苯甲酸是一种用于测试硅醇基对酸性物质的活性羧酸，此方面是色谱柱制造者开发碱性去活色谱柱来作胺类物质分析时经常忽略的。
Uracil(尿嘧啶) pyridine(吡啶) phenol(苯酚)
N,N-dimethylaniline 4-butylbenzoic toluene
N，N-二甲基苯胺 4-正丁基苯甲酸 甲苯
图一 测试混合物组分的结构
我们使用的流动相是含有65%的乙腈和35%的浓度为0.05M的磷酸钾混合溶液，pH值为3.2。pH=3.2的缓冲溶液可使4-正丁基苯甲酸质子化，同时可提高吡啶和N，N-二甲基苯胺的保留时间的重现性。我们发现使用没有加缓冲溶液的流动相，如65%乙腈和35%水，即使我们使用同一瓶流动相，也无法得到重现性较好的保留时间和峰形。高离子强度的缓冲溶液，如本次测试所使用的0.05M的缓冲溶液，会抑制一些硅醇基的活性（2，5），但对于将胺从一些非碱性去活的反相色谱柱中洗脱下来，有一些抑制作用是必要的。
我们测试过另外两种缓冲溶液，但它们的作用均少于pH=3.2的0.05M磷酸钾溶液。0.01M磷酸钾缓冲溶液在pH=3.2时，胺类化合物在有些色谱柱中产生前移峰。0.05M磷酸钾缓冲溶液在pH=7时，胺类物质产生的峰形比在pH=3.2时更好。吡啶和N，N-二甲基苯胺的pKa均大约为5.2；因此，这些组分在pH=7时未质子化并且呈中性，同时并不与强酸性的硅醇基发生离子交换作用。
实验部分
配制0.05M的磷酸钾缓冲溶液， 将6.8g的磷酸二氢钾加入1L HPLC级的水中。加入浓磷酸直至pH=3.15-3.2（控制缓冲溶液的pH值在此范围是非常重要的，因为吡啶和N，N-二甲基苯胺对pH值非常敏感），用650ml 乙腈和350ml 缓冲溶液混合来配制流动相，此混合物经孔径为0.45um的过滤器过滤。为了检测流动相配制是否正确，我们将测试混合物注射入一根色谱柱与此混合物在另一批正在使用的流动相中的保留因子作比较。
制备100ml测试混合物，先将65ml乙腈和4mg尿嘧啶，15mg吡啶，40mg苯酚，15mgN，N-二甲基苯胺，30mg4-正丁烷苯甲酸及400mg甲苯混合，超声波处理一会，然后加入35mlHPLC级的水，再超声波处理直到所有固体溶解（将此测试混合物装入2ml的瓶子，编号为1092，由Alltech Associates 提供）。同时准备各种物质的标准品，其浓度与在测试混合物中的浓度相同。
流速为1.0ml/min，注射器容量为10ul，柱温为19-22℃，使用紫外吸收检测器，波长为254nm。关于色谱柱的直径， 除了Alltech 的alphaBond C-18和Waters的uBondapak C-18柱 （30cm×3.9 mm）及Waters的Symmetry C-18和C-8柱 （15cm×3.9mm）之外，所有色谱柱均为15cm×4.6mm.
关于填料颗粒直径，除了Altech 的Adsorbosphere XL ODS (3um)；Waters 的Nova-Pak C-18(4um)；Synchrom 的Synchropak RPP C-18,300 (6.5um)和Waters的uBondapak C-18、Alltech的Versapack C-18、Alltech 的alphaBond C-18 以及Whatman 的Partisil OPS 和Partidil ODS-2 （全是10um）以外，其余所有色谱柱均为5um。颗粒的尺寸仅作为介绍而列出来，如果制造者在制备各种尺寸的颗粒时使用相同的硅基和键合过程，则颗粒的尺寸不影响保留时间、选择性或峰形。
在比较中使用的色谱柱全是新的，不是刚填充填料的就是近来购买的。用多于20倍柱容积的流动相来冲洗所有色谱柱，并且重复地注射测试混合物直到各组分的保留时间变化少于0.02min。
我们注射入标样来确定各组分的出峰顺序并用所获得的简洁的色谱图来计算拖尾因子。我们没有使用柱加热器来控制柱温，但我们确保了实验的环境温度波动少于3℃，环境温度变化引起的保留因子变化少于3%，这样温度的变化在这次比较中可忽略不计。
保留因子用k=(tr-t0)/t0来计算，式中tr是要检测峰的保留时间，t0是尿嘧啶的死时间。计算拖尾因子（T）是使用美国药典的公式T=W0.05/2f，式中W0.05是峰高5%处的峰宽，f是峰高5%处的峰的前沿边缘到垂直的最大半峰宽。