摘要:采用毛细管气相色谱对4种中成药中2-莰醇的质量分数进行了快速测定。结果表明:分析时间4min,当内标物与2-莰醇的质量比为1∶0.25～1∶1时,峰面积比与质量比呈线性关系, 线性方程为y = 0.5178 x + 0.0768 , 相关系数r=0.9954。平均校正因子为1.5625 ,样品平均回收率92.72 % , 样品分析相对标准偏差值1.05 %～2.55 %。
关键词:毛细管气相色谱法;中成药;2-莰醇
2-莰醇(borneol ,C10H17OH) 是饱和双环萜醇,亦称为樟醇或冰片,由其2种立体异构体龙脑和异龙脑组成,主要存在于菊科Compositae植物艾纳香Blumea balsamifera 和龙脑香科Diteroearpaceae 植物龙脑香Dryobalanops aromatica 中,可经水蒸气蒸馏冷却后得到其结晶。化学上亦可采用松节油为原料进行人工合成。其熔点为208℃, 味似薄荷, 有清热解痛, 醒神明目等功效,广泛应用于牛黄解毒片、冰硼散和人丹等数十味中成药中。传统的定性方法采用2-莰醇升华后溶解于乙醇,加新制1 %香草醛硫酸,呈现紫红色来确定其存在;定量则采用质量法或薄层扫描法进行测定。吕晴、刘群分别采用正十二烷和联苯为内标对中成药2-莰醇质量分数进行了测定,宋洪涛等、阎正等和刘杰等采用萘为内标分别对人体血浆、贴膏和中成药中的2-莰醇质量分数进行了测定,用时8～12min。作者用HP25毛细管色谱柱作分离柱,樟脑作内标物,气相色谱法对4种中成药中的2-莰醇进行定性定量测定。采用该方法分析具有试剂用量少、方法简单和周期短等优点。
实验部分
1.1 主要仪器与试剂
1.1.1 仪器 美国Agilent 6890 双通道气相色谱仪(配三锐色谱工作站) , Explayer OHAus 分析天平(1/ 10000) ,高速离心机, 超声波清洗器,冰箱,微量进样针。
1.1.2 试剂 2-莰醇, 化学对照品(中国药品生物制品研究所),樟脑(AR),乙醚(AR) 。
1.1.3 材料 牛黄解毒片(贵州百灵制药有限公司, 批号040206) ; 克痢痧(浙江可立思安制药有限公司, 批号20020618) ; 人丹(上海中华制药厂, 批号020413) , 均为市售。冰硼散(浙江东方制药有限公司, 浙卫药准字19962020902 , 在室温下存放, 家用) 。22莰醇空白药品为猴头菌片(山西临汾云鹏药业有限公司, 批号20030508) 。
1.2 分析测试条件
分析条件参照文献配置, 并在预备试验后确定色谱条件和参数。进样口参数: 温度为150℃, 压力25.0 Pa , 分流比75∶1。色谱柱: HP-5石英毛细管柱,柱径为0.25mm,柱长30m。载气:N2(99.999%)。检测器参数: 检测器为FID ,温度200℃, H2流量25.0mL/min, Air 流量350mL/min。柱温箱参数: 程序升温从100℃到120℃, 升温速率为5 ℃/min。
1.3 样品的提取方法
样品预处理: 样品如有胞衣, 则先去胞衣; 颗粒状样品放置于碾钵中碾成粉末状后再称量。精确称取样品0.8～2.3g , 放置于具塞试管中, 用乙醚在超声震荡环境中10min , 取出后放于离心机中,转速1200r/min,离心3 min , 取出将上层清液转移到10mL容量瓶中,提取3次。将提取液合并定容到刻度,摇匀,放置于冰水浴中,存放于冰箱, 供色谱分析测试用。
1.4 内标的选择
在参阅有关文献的基础上考察了萘、联苯、正十二烷和樟脑作为内标进行筛选。在相同的色谱条件下萘和正十二烷在22莰醇后面出峰。经预备实验得到色谱图, 樟脑稍早于22莰醇出峰, 且分离清楚。考虑到22莰醇可以看作是樟脑的还原产物, 两者结构和性质相似, 两者出峰时间接近, 作为内标可以较准确地定量。
1.5 线性范围和校正因子试验
精确称取20,40,60,80,100mg 2-莰醇置于10mL容量瓶中,加入经计算后精密称量的樟脑,使2-莰醇与樟脑质量比在0.2 , 0.4 , 0.6 , 0.8 , 1.0 附近。用乙醚溶解后定容摇匀, 放于冰箱的冰水浴中, 供气相色谱分析。精确吸取0.5μL , 按1.2 节色谱条件测定, 记录樟脑峰、异龙脑和龙脑峰面积。
1.6 2-莰醇回收率的试验
称取1.0840 g 2-莰醇溶解于乙醚,在100mL容量瓶中定容;分别移取10mL加到5份1.2～2.0g不含2-莰醇的中成药猴头菌片(经色谱分析在相同的色谱条件下, 8min内无色谱峰) ,混合均匀,待乙醚挥发。将加入2-莰醇的猴头菌片按照1.3节方法提取2-莰醇, 然后加入含111.4 g/L的樟脑标准溶液1.00mL ,定容到10mL,供色谱分析测试。精确吸取0.5μL 进样, 按1.2节色谱条件测定,记录樟脑峰、异龙脑和龙脑峰面积。
1.7 样品的测定及计算方法
将样品按1.3 节提取后, 精确吸取的溶液0.5μL 进样, 按1.2节色谱条件测定, 记录樟脑峰、异龙脑和龙脑峰面积。测定的样品气相色谱图, 按照下列公式计算: wi = f ×Ai/As×ws , W =wi/M×1 000。
wi , Ai 分别为样品质量和峰面积(龙脑和异龙脑峰面积之和) , ws , As 分别为内标质量和峰面积, f
为平均校正因子。W 为被测定样品中2-莰醇的质量分数(mg/g) , M 为被测定样品的质量。
2 结果与分析
2 .1 线性范围的确定和校正因子的测定
2.1.1 线性范围的确定 22莰醇由于其立体异构体的存在, 色谱图中可以观察到2个峰, 分别为右旋峰(异龙脑) 和左旋峰(龙脑) , 因此, 在计算22莰醇峰面积时以其2 个峰面积之和计算。以样品峰面积和相对应的内标峰面积比值( Ai / As ) 对样品质量和相对应的内标质量比值(Wi /Ws ) 进行线性回归分析。其回归直线方程为y = 0.5178 x + 0.0768,相关系数r=0.9954。由此可见,样品中的2-莰醇质量和内标物质量比值落在该范围内, 则能够准确的定量。
2.1.2 校正因子的测定 将5个标准溶液所测定的气相色谱图, 按照公式计算。
分别求出相对校正因子和平均相对校正因子, 计算相对标准偏差,
2.2 回收率的测定
可见, 2-莰醇的回收率在85.29 %～ 98.65 %之间, 平均回收率为92.72 % ,回收情况一般。随着空白药品量的增加, 其回收率逐渐降低, 主要由于相同用量的乙醚难以将量较多空白药品中的2-莰醇提取出来。
2.3 样品分析测试结果
采用保留时间对照定性, 可以看到, 樟脑峰和2-莰醇的2个峰分离清楚, 在相同的色谱条件下各个峰的拟合情况很好; 内标选择妥当, 因此可以良好的定性和定量。在样品分析中, 如果存在样品中2-莰醇质量分数过大可以采用样品称量减少, 降低质量分数或在色谱条件中加大分流比。
从质量分数测定值与药典中方剂的计算值相比较来看,牛黄解毒片的测定值高于药典计算值5.4mg/g,克痢痧的测定值低于药典计算值1.9mg/g; 但冰硼散由于生产日期距测定时间太久, 导致2-莰醇升华挥发,质量分数降低。各种药品在测定时要特别注意其是否具有干扰因素存在。
3 小结
2-莰醇可以看作是樟脑的还原产物, 在相同的色谱条件下, 比22莰醇出峰时间稍早, 作为内标可以较准确地定量, 定量校正因子为1.5625。在测定过程中特别要求注意在样品中是否有与内标物樟脑相同的成分, 若有, 则要寻求其他物质作为内标; 注意是否有与目标化合物2-莰醇出峰时间相同或者有重叠的成分, 如果有, 则可以改变色谱条件, 使两者完全分离后再测定; 同时要注意药品在测定时是否具有其他干扰因素存在。内标法定量的关键是选择合适的内标, 内标物峰与被测定物锋相邻近, 峰分离清楚, 峰值之间具有相关性。
该实验采用乙醚作为2-莰醇的提取剂, 主要由于它对2-莰醇溶解效率高, 但因为其沸点仅为34.6℃, 极易挥发, 因此实验要求在底温的环境下进行, 否则容易引起2-莰醇的损失。采用乙醚作为提取剂, 回收率85.29 %～98.65 % , 平均回收率为92.72 %。实验也可以考虑采用正己烷、二氯甲烷和乙酸乙酯等单一或混合溶剂对目标化合物进行提取。
在测定中要考虑目标化合物在色谱柱上的分离效率以及检测器对目标化合物是否有响应。从色谱图上可以看出, 2-莰醇在HP2柱上, 采用100℃开始程序升温到120℃,升温速率5℃/min,4min内组分可以完全流出,分析周期短, 检测器对2-莰醇和樟脑响应优良。
