摘要 目的：对90年代以来经皮给药系统研究的体内分析方法进行综述。方法： 根据文献分类综述，内容包括样品处理和分析方法如高效液相色谱法(HPLC)、气 相色谱法(GC)、气相色谱-质谱联用法(GC-MS)、放射免疫分析法(RIA)等，并对微 量透析法被引入经皮给药动力学研究中的应用作了介绍。结果与结论：经皮给药 系统的体内分析方法仍需检测方法和手段上不断发展，以进一步促进经皮给药制 剂的研究。
关键词 经皮给药系统；体内分析
体内分析对于研究药物在体内的吸收、分布、代谢、排规律，了解药物的体 内作用过程具有重要意义，在生物利用度、药动学等的研究中也具有不可替代的 作用。体内分析的对象包括血液、器官、组织、体液及排泄物等，应用最多的是 血药及尿药浓度的测定。经皮给药系统(TTS)的药物一般剂量都较小，且不能完 全穿透具有多层生物膜结构的皮肤，经体内吸收的量少，同时存在众多的干扰杂 质，难以分离纯化，因而对体内药物浓度的直接检测要求较高。笔者拟就90年代 以来经皮给药系统的体内分析法特别是直接分析法作一介绍。
1 样品处理
经皮给药后采取的体内样品若不能立即进行分析，则存在样品的保存问题。 对于血样，应在采血后离心或加入适宜的抗凝剂后离心，得到血清或血浆样品， 然后置-20 ℃或以下温度冷冻保存备用；对于尿样，应收集一定时间内的总尿， 以避免药物的损失，并置冰箱冷藏或加入防腐剂后保存。
在样品的检测前，还需进行组分的萃取、分离、纯化、富集，去除蛋白及杂质，浓集样品，以适应检测手段的需要。对于不同的药物、不同的检测手段，其 前处理过程也不一样。 如有的采用有机溶剂萃取，有的采用固-液萃取，还有的 可直接进样，即需对具体情况酌情处理。
2 分析方法
经皮给药系统的体内分析法大体分为直接和间接法。直接法即直接测定经皮 给药后的体内药物及代谢物浓度，这对了解药物的体内过程具有直接的意义；间 接法主要通过测定标记药物在生物样品的放射活性，间接获得药物在体内的作用过程，如在月桂氮酮的促渗机制研究中，用14 C进行标记，液闪法测定尿样放 射活性，得到单剂量和多剂量月桂氮酮的经皮吸收。也可通过测定与经皮 给药有关的生理反应或引起的其它体内化学物质浓度变化间接获得，如胰岛素的 经皮给药系统可通过测定体内血糖浓度变化间接获得胰岛素在体内的作用过程。
2.1 高效液相色谱法(HPLC)
高效液相色谱法在生物分析中占有重要的地位，在TTS的体内分析中同样也经常应用。但常规的HPLC已不能适用于TTS体内分析的要求，必须结合药物的结构、 理化性质和样品特点，改进样品的分离、富集方法，或选择合适的检测器来提高 检测的灵敏度，达到可应用于TTS体内分析的目的，如噻吗洛尔透皮给药后血浆药浓的测定中，以Zorbax ODS柱分离，乙腈-水-三乙胺-磷酸(22∶78∶10∶1)为流动相，配以二极管阵列检测器，检测限达到2 ng*ml-1，在5 ng*ml-1～60 ng*ml-1 范围内线性关系良好。在样品处理中先用NaOH碱化，用乙醚提取血浆中噻吗洛尔， 回收率高，重现性好，建立了切实可行的噻吗洛尔经皮吸收的体内检测方法。在东莨菪碱TTS的测定中，样品经过浓缩，C18柱净化和氰基固相柱萃取，用电化学检测器(氧化电位+0.9V)测定，检测限达5 ng*ml-1，该法用于东莨菪碱TTS的 尿药浓度测定，获得了该药的平均代谢速率。阮丽萍等 用HPLC测定了硝苯啶贴膜剂的体内血药浓度，采用YWG-C18(10 μm，250 mm×4 mm)RP-HPLC，流动相为甲醇-水(80∶20)，尼群地平为内标物，紫外检测器检测(238 nm)，线性范围 为5 ng*ml-1～200 ng*ml-1。采用此法对硝苯啶贴膜剂的人体药动学进行了研究。 Roy等用HPLC测定酮咯酸(ketorolac acid)的经皮吸收，以Spherisorb ODS Ⅰ柱 (5 μm，250 mm×4.5 mm)，乙腈-水-醋酸(44∶53∶1，pH=3.0)为流动相，紫外 检测器检测(314 nm)，采用此法测定了酮咯酸在人体中的生物利用度。
2.2 气相色谱法(GC)
GC在TTS的体内分析中也有应用，杨秀明等使用GC-FID，测定了使用戒 烟贴剂后尿中烟碱的含量，色谱柱(2.6 m×2.1 mm)填充8% PEG(20 000)+20 g*L-1KOH涂在Chromosorb W担体上，柱温162 ℃，气化室温度249 ℃，N2为载气，流 速50 ml*min-1，采用N-甲基吡咯烷酮为内标物，线性范围为10 ng*ml-1～150 ng*ml-1。 Mulligan等同样采用GC-FID测定了使用烟碱贴片后的血药和尿药浓度。色谱柱为50%苯甲基硅氧烷毛细管柱(10 m×0.53 mm)，程序升温，以假木贼碱为内标物，
对烟碱的检测限达1 ng*ml-1(血浆)和10 ng*ml-1(尿)，采用此法对烟碱透皮贴片的临床药动学性质进行了研究。Gupta等用GC-NPD测定血浆中的烟碱浓度，检测限达2 ng*ml-1，在5.0 ng*ml-1～80 ng*ml-1范围内日内RSD为3.3%～10.7%， 同样取到了较好的结果。
GC要求被测组分或其衍生物必须具有一定的挥发性和热稳定性，烟碱及其衍 生物可铁宁(cotinine)能够满足此要求，然而对于其它适合经皮给药的药物不一 定满足此条件，加之必须自己制备色谱柱，因此GC在经皮给药体内分析中的应用 还不如HPLC广泛。
2.3 气相色谱-质谱(GC-MS)联用法
GC-MS在生物分析中的应用备受重视，它将GC的高分辨率和MS检测的高灵敏度结合在一起，为生物分析提供了一种有效的手段，同样也为经皮给药的体内分析提供了一种方法。在应用GC-MS定量时，通常以稳定性同位素标记的药物或结构类 似的其它药物或化合物作为内标，采用选择性离子监测技术(SIM)，此分析方法的 灵敏度高，可测定药物浓度低至0.1 ng*ml-1的体液样品，因此尤其适合经皮给药后低血药浓度的检测，如对烟碱贴片的研究，就是在给予TTS的同时 静脉滴注稳定性同位素氘(D)标记的烟碱，用SIM技术检测，检测限达0.9 ng*ml-1， 获得了烟碱贴片的绝对生物利用度，并同时得到烟碱贴片的药动学参数。在对可乐定血药浓度的测定中，应用GC-MS-SIM，样品制备包括固相萃取和衍生化 过程两步，检测限达到0.025 ng*ml-1，并将此法运用到可乐定透皮给药的临床研究中。此外还应用GC-MS测定血药浓度、GC-ECD(63 Ni)测定尿药浓度，比较 了可乐定po给药和透皮给药的药动学及药效学和安全性。Kochak等用15 N标记硝酸甘油，用毛细管柱气-液色谱分离，内标采用1，2，4-丁三醇三硝酸酯，SIM分别选择在m/z为62，63，62，检测限达50 pg*ml-1，成功地进行了硝酸甘油透 皮给药的研究。Sun等用静滴15 N标记的硝酸甘油，与未标记的硝酸甘油贴片 同时给药，比较了三种硝酸甘油贴片蹬药动学参数和生物利用度。由于GC-MS进样 量少，扫描时间快，SIM灵敏度高，因此是一种研究经皮给药后体内药浓分析有前途的方法。
2.4 放射免疫法(RIA)
RIA是一种竞争蛋白结合分析法，随着很多RIA药盒的商品化，RIA在生物分析 中的应用越来越广泛，目前也有一些透皮给药的体内测定采用RIA，以满足透皮给 药后低药浓样品检测的需要，如抗肿瘤药物亮丙瑞林(leuprolide)、激素类药物促黄体激素、睾酮、雌酚酮、雌二醇，抗组胺药物苯丙烯啶(triprolidine)，抗抑郁药物洛利普利(rolipram)。
3 其 它
长期以来，由于缺乏有效的手段直接测定经皮给药后的血药浓度，困扰着人们对TTS动力学的进一步研究，近年Hegemann等将微量透析法引入，为经皮给药 体内分析提供了一种新方法。微量透析法过去一直作为神经药理学的研究方法，用 于测定神经递质，即在组织中植入一支薄的具半透性的透析管，模仿毛细管的作用， 通过透析，对透析液进行分析，分析结果反映细胞外液的组分。以往在人体皮肤研究中，微量透析法迄今为止局限于测定内源性成分，如葡萄糖、组胺等，也用于测 定皮肤的屏障作用。Hegemann等将微量透析引入经皮给药的研究中，以烟碱为模型 药物，需测定皮肤中的烟碱浓度而不是血中的浓度，因透析液中的药物浓度与透析组织中药物浓度的关系事先在体外实验中得到证实，并假设在体内也有这种类似的关系，由此可通过透析液药物浓度的测定从皮肤中获得有关的药动学参数。因皮肤中的烟碱浓度可达4 μg*ml-1～18 μg*ml-1，是相应的血中浓度的500倍，因此对检测手段的要求显著降低，用一般的HPLC即可获得解决。微量透析法为经皮给药尤其是局部经皮给药的药动学研究打开了一个新的领域，并可望成为一种有效的研究手段。
综上所述，色谱法(HPLC，GC，GC-MS)和放射免疫法是经皮给药体内分析的主 要方法，比较起来，尽管放射免疫法具有灵敏度高的特点，但由于存在抗体的制备问题，其应用受到一定的限制，而色谱法却相对较为普及，可以根据药物的结构特点，利用色谱柱进行分离、富集，再配以不同的检测器，可提高检测的灵敏度。此外，同位素示踪技术在经皮给药的测定中也用得较为普遍，尤其为了获得经皮给药的生物利用度，将TTS与经同位素标记的药物同时应用于动物或人体，可获得TTS与 口服或注射相比较的生物利用度。微量透析法应用于经皮给药的研究是一种新的尝试，尽管还需在不同的药物中进行验证，但不失为一种可借鉴的方法。
虽然有许多其它的经皮给药吸收的检测方法，如病理学检查法，体外剩余量检测法等，但直接测定经皮给药后的血药浓度仍是人们追求的目标，因此目前在很大程度上影响着经皮给药研究的进展，甚至有人认为它是经皮给药研究中的拦路虎。 随着新的分析方法的出现，检测手段的提高，相信会对经皮给药制剂的研究起到促 进作用。