摘要:选取黄芩苷、栀子苷和胆酸三种复方清开灵注射液中的主要活性成分为指标,运用高效液相色谱法和紫外分析法,测定其在全方和脑脊液、血浆、血清样品中的经时变化浓度,进而间接表征整个中药复方在体内的变化情况,为中药复方的体内样品研究提供了一定的方法模式。
关键词:清开灵注射液;体内样品;高效液相色谱法;紫外分析法
清开灵注射液,是从古方安宫牛黄丸拆方改制而成的一种中药注射液。是国家中药保护品种,具有保护肝脏,促进损伤肝细胞的修复,清热解毒,镇静安神等作用。由牛黄、珍珠母、板蓝根、水牛角、黄芩、栀子、金银花七味药组成。传统上,以牛黄为君,水牛角为臣,黄芩、栀子、金银花、板蓝根为佐,珍珠母为使。其中牛黄通过直接加入牛胆酸钠和猪去氧胆酸钠来代替,具有清热解毒、镇心止惊、利痰开窍的功效;黄芩通过直接加入含量90 %以上的黄芩苷代替,黄芩苷是复方中含量最高的成分,具有泻实火、清湿热的功效;另外,栀子、金银花、板蓝根、水牛角和珍珠母五味药材通过药材提取液的形式入药,栀子苷是复方中含量较高的成分,具有清热泻火、利便止血的功用。目前,对清开灵注射液的体外化学成分分析、质量控制已作了较多研究;但对其体内样品的研究则相对较少。药物的体内样品分析是药物研究的关键步骤,在中药现代化研究过程中也是同样重要。鉴于中药本身化学成分的复杂性和大量未知成分的存在,加上体内复杂基质的干扰,中药的体内样品分析是有相当难度的。本文以清开灵注射液为中药体内样品分析的研究载体,利用现代分析手段(高效液相色谱法和紫外分析) ,分别测定了清开灵注射液全方、黄芩提取物、栀子提取物和胆酸的经时脑脊液、血浆、血清样品;选取了黄芩苷、栀子苷和总胆酸这三种复方清开灵中的主要活性成分为指标,以其在体内的变化间接的表征整个中药复方的体内变化情况,拟为中药,特别是中药复方的体内样品研究提供一定的方法模式。
1 原料与仪器
原料：甲醇、乙腈( Fisher 公司,色谱纯) ,甲酸、氯化铁、浓硫酸(分析纯) , 二次蒸馏水( 自制) , 容量瓶( 2ml 、10ml) ,复方清开灵注射液、黄芩提取物、栀子提取液和胆酸的脑脊液、血浆、血清样品(各1 、2 、4 、8 、12 、16 、24 小时) 由北京中医药大学提供,栀子苷、黄芩苷和牛胆酸标准品购于中国药品生物制品检定所。
仪器：岛津LC - 2010A 型高效液相色谱仪(带有SPD- M10A 型二极管阵列检测器,自动进样装置) ,UV - 1100型紫外可见分光光度计(北京瑞利分析仪器公司) ,SZ - 93自动双重纯水蒸馏器(上海亚荣生化仪器厂) ,离心机(LD5- 2A 型,北京医用离心机厂)
2 实验方法
供试品和标准品的制备：供试品: 取各体内样品,在37 ℃水浴中闭光解冻,温育2 小时后,8000 转/ 分钟离心15分钟,取上清液;以3 倍量甲醇沉淀蛋白,离心后取上清液约1ml ,甲醇定容至2ml ,即得供试品。
标准品：精密称取各标准品,分别溶于甲醇,配制成浓度为0. 40 、0. 45 、0. 50 、0. 55 、0. 60mg/ ml 的黄芩苷、栀子苷和牛胆酸标准溶液。
对于胆酸样品,精密吸取供试品1ml 置于10ml 量瓶中,加入浓硫酸1ml ,氯化铁试液0. 1ml ,摇匀,放置15 分钟,以浓硫酸稀释至刻度,放置50 分钟, (空白采用相同供试液,按照上述步骤,将氯化铁换为水即可) ,即得紫外测定供试品。
实验条件：高效液相色谱条件：经过实验摸索,确定为水- 乙腈体系为液相色谱流定相:A 相为甲酸水溶液(调节pH 值为4. 5) ,B 相为乙腈。线性梯度洗脱时间程序如下。开始时0 %B ,50 分钟时100 %B。色谱柱: PhenomenexLuna C18 色谱柱( 250mm ×4. 6mm , 5μ) ; 进样量20μl ; 柱温为30 ℃;检测波长为238nm(对于栀子苷) 和280nm(对于黄芩苷) 在上述条件下,栀子苷和黄芩苷可以在复杂体系中达到较好的分离,其中黄芩苷的保留时间为约30 分钟,栀子苷的保留时间为约35. 5 分钟。
紫外分光光度法条件：470nm下进行测定。
方法学考察 1. 精密度:取各供试品,连续进样5 次,在上述液相色谱和紫外光谱条件下,分别对三种物质进行定量测定,以峰面积值为指标分别计算RSD%,考察方法的精密度。
2. 重复性:平行处理得到各供试品溶液5 份,在上述液相色谱和紫外光谱条件下,分别对三种物质进行定量测定,以峰面积值为指标分别计算RSD % ,考察方法的重复性。
3. 回收率:在已知三种成分含量的供试品溶液中,分别定量加入各标准品,考察方法的平均加样回收率(n = 5) 。
精密度、重复性及加样回收率结果表明,方法的精密度、重复性及加样回收率均符合定量要求。
标准曲线的制作：在上述色谱和光谱条件下,各成分分别在5 个浓度点,平行测定3 次。对于栀子苷和黄芩苷,用平均峰面积( Y) 对浓度(X) 进行线性回归;对于胆酸,用紫外吸光度(A) 对浓度(X) 进行线性回归,结果表明各成分在各自浓度范围内线性关系良好。回归方程,相关系数,线性范围及检出限结果(S/ N = 2) 。
体内变化趋势图的制作：在上述色谱和光谱条件下,分别测定复方清开灵注射液、黄芩提取物、栀子提取液和胆酸的脑脊液、血浆、血清样品(各1 、2 、4 、8 、12 、16 、24 小时) ,并利用标准曲线计算出其中栀子苷、黄芩苷、总胆酸的含量。分别以三种物质的浓度(C) 对取样时间(t) 作图。
3 讨论
由于体内样品测定过程中,受到基质成分干扰,给多成分检测带来了一定的难度,因此,本文采用占入药原料提取物总固体物量50 %以上,并经证明具有药效活性的成分作为指标进行测定:其中栀子提取物以占总固体物量50 %～60 %的栀子苷计,黄芩提取物以占总固体物量不小于92 %的黄芩苷计,胆酸以总胆酸(牛胆酸+ 猪胆酸) 计。在脑脊液、血浆、血清三类体液样品中,均可检出栀子苷,说明栀子苷透过了血脑屏障。同时由图1 可以看出,在三个体液环境下,栀子苷呈相同的积累和消除趋势,达峰时间均在0. 5～1 小时(其中脑脊液样品稍有拖后,在1～2 小时) ;24 小时内基本完全消除;而从达峰时的含量来看,脑脊液样品浓度低于血浆和血清样品(约占总量50 %～60 %左右) ,说明栀子成分大部分会集中于中枢神经系统中。比较全方与栀子提取物的测定曲线可以看出,在三个体液环境中,样品所存在共有成分对栀子成分有较大的促进作用:全方测定曲线下面积大于栀子提取物,说明在相同处方量情况下,全方体内有效成分总量大于栀子提取物;栀子提取物达峰浓度小于全方达峰浓度,说明全方提高了有效血药浓度;由达峰数值还可看出,在前4 小时中栀子提取物中栀子苷的消除速率明显快于全方。而将达峰时全方浓度与栀子提取物浓度相比较,在三个体液环境中,比值没有明显差异(血浆中1. 18 ,血清中1. 20 ,脑脊液中1. 17) ,这说明栀子苷成分在体内不同部位具有相似的积累和消除特征的同时,在提取物与复方中也保持相似的体内特征,成分本身体内效应变化不受分布部位和共存物质的影响;方剂中其他共存组分仅会增加栀子苷的有效血药浓度,而其本身的代谢过程没有受到影响。
在脑脊液中没有检出黄芩苷,可以推测黄芩提取物并未通过血脑屏障;在血浆和血清样品的测定结果中可以看出,黄芩苷达峰时间均为0. 5～1. 5 小时,24 小时后大部分被消除;比较全方与黄芩提取物的测定曲线可以看出,血浆和血清中黄芩苷的测定值相当,均稍大于全方测定值,说明在血液中,黄芩成分基本不受样品共存物质影响。
胆酸为内源性物质,正常体内胆汁酸经过肝肠循环,处于一种平衡,但仍有1 %左右进入血液;胆酸在脑脊液样品中没有测出,可以推测胆酸并未通过血脑屏障;在血清和血浆样品中,5 个小时后会达到一个稳定水平,经过样品空白测定,这个稳定水平为正常体内的胆酸水平;而5 小时后,会产生双峰现象,这是可能由于体内代偿性胆酸分泌所致。
在体外提取物间混合过程可以发现看出,胆酸有利于黄芩和栀子提取物的溶解,但这仍需要进行指标定量以确证。这样,胆酸类物质在中药注射剂中与其他药材成分的相互作用,成为了一个关键性的研究问题;不同种胆酸含量比例的变化及其对整体药效的影响仍需要深入的研究探讨。胆酸、黄芩苷均不透过血脑屏障,而栀子苷大量透过,这与栀子“清三焦湿热”的理论相符合。由于中医认为三焦与内脏最为密切的是心包络,同时心主神明与主血脉,说明栀子用于治疗脑水肿的重要作用;另外,结合黄芩- 栀子药对,二者相须为用,降泄同施,气血并治,栀子得黄芩之助加强了其清三焦火热、祛湿解毒的功效;同时胆酸增加了栀子提取物的溶解程度,而在体内显示,减缓了栀子苷的消除。因此,学术界认为“, 栀子为复方清开灵中最重要的药味”的说法,有着一定的理论和实践依据;而对于胆酸则需要进一步的研究和认识,原有牛黄- 珍珠药对具有清心定惊、豁痰开窍的功能,是否对胆酸功能有所提示,值得深入研究。
