化橘红为芸香科植物化州柚Citrus grandis‘Tomentosa’或柚Citrus grandis(L.)Osbeck的未成熟或近成熟的干燥外层果皮。2005版《中国药典》对其含量测定是以柚皮苷为指标,采用高效液相色谱法测定。文献报道的化橘红及其制剂的含量测定方法主要为高效液相色谱法、薄层扫描法、分光光度法等。
一、高效液相色谱法
⑴2005版《中国药典》化橘红含量测定项下:
色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;以甲醇-醋酸-水(35:4:61)为流动相,检测波长为283nm。理论板数按柚皮苷峰计算应不低于1000。
供试品溶液的制备 取本品粗粉约1克,精密称定,置索氏提取器中,加石油醚(60--90℃)80ml,加热回流2~3小时,弃去石油醚,药渣挥去石油醚,加甲醇80ml,加热回流3小时至提取液无色,放冷,滤过,滤液置100ml量瓶中,用少量甲醇分数次洗涤容器,洗液滤入同一量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀。精密量取5ml,置25ml量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀,即得。
⑵文献报道的HPLC法
文献报道的用HPLC法测定柚皮苷的含量,所用的流动相系统一般为甲醇-醋酸-水或乙腈-醋酸-水系统,检测波长为283nm。现举两例如下:
杨燕军等测定广东蛇药主药柚叶中有效成分柚皮苷的含量。采用RP-HPLC法,固定相为Hypersi1 BDS C18(5 μm,4.6mm×250mm);流动相为甲醇-水-醋酸(35:61:4);流速为1.0mL/min;检测波长为283nm;柱温为室温;进样量为10μL。供试品溶液的制备:石油醚加热回流1 h,倾出石油醚,挥干,分别加入95%乙醇40 mL,回流提取2次,每次1h,用少量乙醇洗涤柚叶残渣3次,合并乙醇回流提取液及洗涤液,挥去乙醇,残渣用热水少量多次溶解,过滤于10mL容量瓶中定容;精密吸取3mL于10mL容量瓶中,用水定容,0.45μm微孔滤膜过滤,即得。
毛春红等测定橘红止咳露中柚皮苷的含量。采用HPLC法以乙腈-水-冰醋酸为流动相,色谱柱为Kromasil C18柱,流速为1.0mL/min,检测波长283nm。柚皮苷线性范围为120ng~1960ng,加样回收率为98.00%,RSD=1.02%(n=9)。
也有用其它色谱条件的,如:郝明虹等测定气滞胃炎颗粒中柚皮苷的含量。采用YWG-C18柱,流动相:乙腈-水(20:80)再用磷酸调pH=3.0,检测波长230nm。柚皮苷的线性范围为0.1624~1.624μg,r=0.9998,回收率为98.25%,RSD=1.1%。供试品溶液的制备:用水溶解样品,滤过,弃去初滤液,精密量取续滤液3~5ml,加在已处理好的聚酰胺柱(50~8O目,2g,内径1.8cm,湿法装柱),先用30ml水洗脱。弃去水液。再用甲醇50ml洗脱,收集洗脱液并定容至50ml,摇匀,过0.5μm 的微孔滤膜,即得。
二、薄层扫描法
何夏秋等用薄层法鉴别与测定千金救心胶囊中柚皮苷的含量。自制0.3%的羧甲基纤维素钠的硅胶G板,厚度0.5mm,110℃活化lh;氯仿-乙酸乙酯-甲醇=水(15:40 :22:10)10℃以下分层的下层溶液为展开剂,2%的三氯化铝乙醇试液为显色剂。扫描条件:狭缝宽度Slit=0.4×0.4mm,线性化参数Sx=3;测定波长为295nm, 参比波长为400nm。柚皮苷的线性范围在1.18~7.08μg。李晓光等采用薄层扫描法测定化橘红药材中柚皮苷的含量。展开剂:甲苯-乙酸乙酯-丙酮-水-甲酸(2:2.5:5:0.5:0.5)。线性扫描,单波长254nm,光束狭缝6.00mm×0.45mm,灵敏度中等。柚皮苷的线性范围在5~25μg。
三、分光光度法
梁宝英采用紫外分光光度法测定柚枳实中柚皮苷含量。;检测波长284nm。柚皮苷在5.0~30.0μg/ml范围内浓度与吸收度呈良好的线性关系,回归方程:C=31.81A-0.0004,r=0.9997;平均回收率:100.6%,RSD:0.67%。供试品溶液的制备:乙醇索氏提取回流提取1.5小时,溶液于水浴上蒸干,残留物加乙醇使溶解后,过滤,弃去初滤液。精密吸取续滤液lml,置lOOml量瓶中,加乙醇至刻度,精密吸取lOml,置50ml量瓶中,加乙醇至刻度,即得。
五、其它
杨瑛等以苯甲酸钠为内标物,采用胶束电动毛细管电泳法测定柑橘属药材中柚皮苷和橙皮苷的含量。电泳条件:石英毛细管,直径50μm,长度64.5cm,有效长度56cm;缓冲液pH-9.0、0.02mol/L 的硼砂,0.05mol/L 十二烷基硫酸钠(SDS),10%的乙腈,电压20kV;温度25℃;检测波长入=213nm;进样量为10kPa.s。在上述条件下,各药材中柚皮苷、橙皮苷及内标物迁移时间分别为6.5、6.8和10.4min。柚皮苷在200~l000μg、橙皮苷10O~600μg/mL范围内线性关系良好.样品溶液的配制:化橘红、佛手剪成极细条,陈皮、青皮、枳实、枳壳等粉粹成细粉,过筛,分别称约0.5g,置于50 mL容量瓶内.加50%甲醇超声提取30min,放冷至室温,补充损失的溶剂,用0.45μm 微孔滤膜过滤,即得