2.2 2002年以来动物寄生虫分子生物学研究的新进展
从总体上看,国内外对动物寄生虫分子生物学的研究在近几年又有了一些新的进展。分子生物学研究的一些最新技术和最新方法开始在动物寄生虫上应用,使研究的范围有所扩大,研究的深度也有所加强[4-5]。
我国寄生虫分子生物学研究对象和范围有所扩大,在过去研究的基础上对鸡球虫的研究已扩展到了几乎所有种、属和其它动物球虫、隐孢子虫。新增了对羊泰勒虫(Theileria SP)、中华泰勒虫(T. sinensis)、牛巴贝斯虫、环形泰勒虫、绵羊无浆体(Anaplasmaovis)、动物附红细胞体(Eperythrozoon)、伊氏锥虫和犬、猫、牛、羊贾第虫(Giardia)等主要危害种原虫的研究,增加了对土耳其斯坦东毕吸虫、捻转血矛线虫、犬弓首蛔虫、拟地新线虫(P.decipiens)、鸡异刺线虫、猪蛔虫、鸡蛔虫、犬钩虫、盲囊线虫(C.rudolphii)、毛首线虫、犬恶丝虫等寄生蠕虫的分子生物学研究。其中,对鸡球虫、旋毛虫的研究已达到和接近世界先进水平。
建立了一些寄生虫的cDNA文库,开展了部分虫种的分子生物学分类研究。国内一些学者采用RNA抽提、RT-PCR扩增和克隆,进行EnMc-2(Gd)序列分析和与EtMlc-2(Ht)序列比较;或将序列测定结果与登录GenBank的基因进行比对(SI值)等方法,对国内异源、异地的同种或同属不同种的一些寄生性原虫、蠕虫进行了同源性差异鉴定,解决了部分在分类学上有争议虫种的分类学定位问题,在原虫方面表现较为突出。如广东谢明权等对鸡的毒害艾美耳球虫(Eimeria necatrix)广东株、北京株,堆型艾美耳球虫(E.acervulina)北京株、广东株的序列比对,证实为异地同源同种;陶建平等对来自国内外不同地区的11株巨型艾美耳球虫(E.maxima)进行RAPD分析,证实为同一种,但有虫株间亲源关系远近差异;安健等也对柔嫩艾美耳球虫4个不同虫株进行了mRNA的差异显示测定,证实有2株同源,有2株为未知新序列。张浩吉等将本地采集的牛附红细胞体的PCR产物进行鉴定测序,结果与GenBank中登录的温氏附红细胞体(E.wenyonii)的同源性为97%;刘琴等用采自水牛的巴贝斯虫进行PCR扩增后的18s rRNA片段测序,结果与GenBank中登录的15种已知巴贝斯虫均有差异,即定为新种——东方巴贝斯虫(Babesia orientalis),修正了原定种为牛巴贝斯虫的结论;罗建勋等用同种方法对我国8株黄牛的巴贝斯虫进行分类鉴定和比对,确定国内巴贝斯虫为牛巴贝斯虫、双芽巴贝斯虫、大巴贝斯虫、卵形巴贝斯虫和巴贝斯虫未定种共5个种。翁亚彪等用ITS及5.8 S序列分析,证实国内弓形虫QH绵羊株、ZS人株、SH人株、CN猪株的序列完全一致,与GenBank上登录的RH株也一致,均为同一虫种。另外,以分子生物学的多种方法鉴定,显示我国旋毛虫为2个虫种,即猪的T.spiralis和犬的T.nativa,并确认人的旋毛虫病在南方和中原主要由猪旋毛虫种引起,东北主要由犬旋毛虫种引起。
同时,还完成和建立了2种旋毛虫、部分艾美耳球虫、土耳其斯坦东毕吸虫、温氏附红细胞体、猪囊尾蚴、捻转血矛线虫、牛巴贝斯各虫种和水牛东方巴贝斯虫、绵羊无浆体、弓形虫、羊巴贝斯虫、羊泰勒虫、环形泰勒虫、奶牛附红细胞体广西株、贾第虫、日本血吸虫、肝片吸虫、大片吸虫、拟地新线虫、鸡异刺线虫、异尖线虫、鸡蛔虫、猪蛔虫、弓首蛔虫、犬钩虫、猪毛首线虫等虫种的基因测序;并在国内建立了相应的cDNA文库,为寄生虫分子生物学研究创造和提供了更好的基础条件。
扩大了寄生虫分子生物学诊断和检测方法的应用范围,特别在原虫方面有所突破。但因寄生原虫的同属异种较多,吸虫、绦虫、线虫因虫体较大,结构和生长发育过程复杂等原因。应用分子生物学的一般方法进行大多数寄生虫病的诊断和检测,尚存在准确性、特异性较差,交叉反应不易排除的问题;应用高层次分子生物学技术,又存在成本过高、操作复杂、不易推广等困难。
2 .3 动物寄生虫基因工程疫苗的研究进展
利用现代免疫学、生物化学和分子生物学的理论和方法,进行动物寄生虫疫苗的研究,近几年也取得了一系列可喜的进展[5]。
目前,囊尾蚴及棘球蚴基因重组疫苗的研制已基本成功。棘球蚴苗EG95可诱导牛产生96%~100%的保护率;羊带绦虫45W-GST融合蛋白重组虫苗,可诱导羊产生92%以上的保护率,对牛无钩绦虫也有较高保护率,该苗即将进入市场。类似的猪囊尾蚴基因重组苗,减虫率和完全保护率已分别达到99.2%和55.5%。猪囊尾蚴细胞苗的研究也已获得成功,使工厂化规模化生产成为可能。
吸虫疫苗研究较多的是日本血吸虫和肝片吸虫,周金春等(2001)用重组的副肌球蛋白(RSJ 97)免疫水牛,3次免疫后腹部贴片感染日本血吸虫尾蚴,结果免疫组减虫率为49.9%,肝脏减卵率为57.3%。另外,发现GST、FABP、膜蛋白(Sjc 23)、卵黄铁蛋(Ferl)等也是血吸虫疫苗的重要候选抗原;GST还具有交叉反应抗原决定簇,对多种血吸虫都具有抗性,使研制广谱抗血吸虫疫苗成为可能。肝片吸虫的GST重组抗原,可使绵羊感染减少48%、牛减少50%。总体看,有效的吸虫基因重组苗在短期内尚难出现。
血矛线虫、食道口线虫、仰口线虫是主要危害牛、羊的一大类线虫,但抗消化道线虫疫苗的研制至今无大的突破。目前,最有效的是用具有氨酞酶A或M活性的110 ku的整合膜蛋白(H11)制作的疫苗,试验效果非常好,在持续23周人工感染下,可使羔羊达到90%以上保护率,但因抗原分子表位含有复合糖成分,难以在常规载体中表达,而无法进行生产性研制。另外,新的抗原虫或抗外寄生虫基因疫苗也处于初始研究阶段。
寻找新有效候选抗原或通过新的优化组合合成新抗原,新的佐剂载体/传递系统的研究,提高免疫保护率,是当前和今后寄生虫基因疫苗研究的方向和热点。
综上所述,分子生物学与动物寄生虫学的关系日益密切,寄生虫及宿主动物相互关系的分子生物学原理和知识在兽医寄生虫学领域已变得越来越重要,分子生物学技术已经成为研究寄生虫不可缺少的技术手段和方法,应用基因组信息工具将为动物寄生虫学和寄生虫病学的研究提供广阔前景,为保障人、畜健康,促进畜牧业发展发挥重要作用。