恩诺沙星肺靶向微球的研究

　　恩诺沙星(ENR)是兽医专用的第3代氟喹诺酮类抗菌药，有广谱杀菌作用，对革兰氏阴性杆菌和球菌、阳性菌、支原体、衣原体均有杀灭作用，对静止期和生长期的细菌均有效，其杀菌活性依赖于浓度。临床上主要用于各种动物敏感菌引起的各种感染。

随着耐药性的产生导致药物治疗效果的降低，且喹诺酮类药物体内分布广泛，所以在治疗动物的肺炎、支气管炎等呼吸道感染时，要使药物在肺部组织达到有效的浓度，势必增加药物的剂量，这样易造成药物在其他组织中残留的增高并产生一些毒副作用。因此尝试研究恩诺沙星的一种新的剂型—肺靶向微球，利用微球静脉注射后被肺毛细血管机械性滤取而表现肺靶向性，以提高治疗动物的呼吸道疾病的效果，降低毒副作用。目前国内外未见恩诺沙星微球的相关报道。

1 材料与方法

1.1 试验材料 紫外分光光度计(美国UNICAM)；磁力加热搅拌器(德国Heidolph)；光学显微镜(重庆光学仪器厂)；恩诺沙星(东北兽药厂，纯度≥99.4%)；酸性明胶(北京化学试剂公司，等电点为pH 7～9)；液体石蜡(北京化学试剂公司)；Span80(北京中邦德科贸有限公司)。

1.2 空白明胶微球的制备 参照文献［３］并根据单因素考察结果，选定对制备明胶微球(Gelatin microspheres,GMS)影响较大的4个因素；明胶浓度、搅拌速度、乳化剂用量及液体石蜡用量，每个因素选定3个水平，按L9(34)正交设计表(见表1)安排试验设计，筛选出GMS最佳制备工艺条件。

表1 正交设计

1.3 恩诺沙星明胶微球的制备 恩诺沙星明胶微球(Enrofloxacin gelatin microspheres，ENRGMS)是在空白GMS制备工艺基础上，在明胶水溶液中加入一定量ENR混匀作为分散相，照GMS制备过程，即得到ENRGMS。1.4 微球的外观观察和特性测定 使用光学显微镜观察ENRGMS，并用测微尺对其粒径分布进行统计。采用量筒法测定微球的堆密度，固定漏斗法测定休止角，醋酸纤维薄膜电泳法显示带电性，固体粉末法测定临界相对湿度(CRH)。

1.5 微球的载药量与包封率测定

1.5.1 标准曲线的绘制 取ENR标准品加0.1 mol/L NaOH溶解，配制系列浓度(1～9 μg/ml)标准溶液，然后按紫外分光光度法，在272 nm波长处测定吸光度，将结果回归得出标准曲线：A(吸光度)=0.0981C(浓度)-0.0855，r=0.9997，测得高低不同浓度添加的平均回收率为99.95%，变异系数为1.38%(n=4)。

1.5.2 样品药物含量的分析 将ENRGMS用0.1 mol/L NaOH溶液溶解，超声15 min，于37℃恒温振荡6 h，过滤2次后稀释，用紫外分光光度计25℃测定吸光度。载药量=微球中药物总量/明胶微球重量×100；包封率(%)=微球中药物总量/投药量×100。

1.6 ENRGMS的体外释药试验 采用动态透析法 ，精密称取ENR和ENRGMS装入透析袋内，置于加有溶出介质pH7.4磷酸盐缓冲液的锥形瓶中，37℃恒温振荡(100 r/min)，定时取样检测，同时补充等量的溶出介质，测定后计算累计释药百分率，得出体外释药曲线。

1.7 ENRGMS的稳定性考察 取ENRGMS 3批密封于西林瓶中，分别在冰箱(4℃)、室温(25℃)与37℃(RH 75%)放置3个月，最后进行外观形态、料径及其分布、载药量、体外释药特性的考察。

2 结果与分析 

2.1 微球的制备工艺 由极差R确定主次影响因素及用量为：明胶溶液浓度10%，搅拌速度700 r/min，乳化剂为2.0%，水相、油相体积比1∶7.5。以此确定ENRGMS乳化冷凝法工艺为：取30 ml液体石蜡为连续相，加Span 80 0.6 ml置于具塞锥形瓶中，于60℃混匀；取明胶0.4 g，用4 ml双蒸水水浴中完全溶胀，调pH值至5.0后加入0.4 g ENR混匀作为分散相；搅拌下将水相滴入油相，制成W/O型乳剂，再冰浴、加戊二醛交联固化、异丙醇脱水，然后用异丙醇、石油醚洗涤，真空干燥，即得到橙黄色微球。

2.2 微球的外观观察和特性测定结果 光学显微镜下的ENRGMS见图1，粒径分布见表2。通过测微尺测定ENRGMS平均粒径(Dav)为11.71 μm，粒径7～30 μm范围内的微球占总数的92.8%，形态圆整、分散性好、较少粘联。

2.3 微球的载药量与包封率 根据ENR的标准曲线回归方程计算，得到ENRGMS的载药量为38.20±0.37%、包封率为42.96±0.39%(n=3)。

2.4 体外释药试验结果 试验结果表明ENRGMS的48 h释放药量为94.39%，ENR 2 h释放药量为93.24%，从体外释药曲线(图2)计算得出ENR的t1/2约为28 min，ENRGMS的t1/2为6.6 h，ENRGMS有明显的缓释作用，其在最初30 min内有突破效应，之后转为缓释过程，释药可用一级动力学方程描述：ln(1-Q)=0.05724t-0.3147，相关系数r=0.9811。故可推论ENREMS在pH7.4磷酸盐缓冲液中属一级动力学规律释药。

2.5 稳定性考察结果 ENRGMS在冰箱(4℃)、室温(25℃)与37℃(RH 75%)放置3个月，其外观形态、粒径及其分布、载药量、体外释药百分率与考察前均无显著变化，微球稳定性较好。

3 讨论

体内的网状内皮系统(RES，包括肝、脾、肺和骨髓等组织)具有丰富的吞噬细胞，可将一定大小的微粒作为异物而摄取，较大的微粒由于不能滤过毛细血管床，而被机械截留于某些部位。0.1～3 μm的微粒可被动靶向肝脏和脾脏为主的RES，7～30 μm的微粒可被动靶向肺部，而小于50 nm的微粒可靶向骨髓。微球给药系统的靶向性可通过控制颗粒的大小、表面的性质如表面电荷、选择不同表面化学性能的载体材料等来实验。微球的表面性质主要指微球表面所带的电荷及表面亲和力，休止角50°～60°，即可被水润湿的微球最易被吞噬细胞吞噬，且微球表面带较多的正电荷粒子较易到肺，疏水性的粒子易于在肺部沉积。本试验制备的恩诺沙星微球平均粒径为11.71 μm，粒径7～30 μm范围内的微球占总数的92.8%，带正电荷、休止角为57.8°，符合肺靶向的要求，载药量为38.20%有较好的实用性，体外释药试验有明显的缓释作用，室温条件下性质稳定，其肺靶向性及相关参数需在动物体内进一步研究。

近年来，兽医药剂学已经由普通的注射剂、片剂、散剂、预混剂等向缓释、控释、靶向制剂发展。肺靶向微球是药剂学研究的一个热点，在兽医药剂学亦有广阔的应用前景，特别是宠物临床，但相关研究报道很少。