摘 要：引起奶牛乳房炎的病原微生物很多，包括细菌、病毒、真菌、支原体四大类，其中葡萄球菌、链球菌占病原菌的90%～95%。文章就金黄色葡萄球菌(SA)、凝固酶阴性葡萄球菌(CNS)、无乳链球菌(SAG)、犬链球菌(SC)、其他链球菌(OS)、大肠埃希菌(CO)、牛棒状杆菌(CB)、其他菌(OTH)的微生物学快速检测方法做一介绍。这些方法能够把葡萄球菌、链球菌和其他细菌鉴别开来，并能通过试验判定其具体类型，简便易行，费用较低，实用性强，适合牛场推广应用。
关键字：奶牛隐性乳房炎；致病菌；鉴定
奶牛乳房炎是引起奶牛业经济损失的一种重要疾病，目前还没有快速、特异检测奶牛乳房炎主要致病原的方法。普通的检测方法只能根据检测出病原菌的种类、数量大致判断是否发生乳房炎，而且用生化鉴定管进行鉴定至少需要28 h才能确诊，费时、费力、检测速度慢[1-2]。但乳汁的微生物检测可以确定感染动物病原微生物的具体种类，从而为临床治疗提供可靠依据，其他方法多不具有此特点。本文主要介绍了在送检乳样经细菌分离培养后，如何通过菌落特性、染色镜检和生化试验快速、简便地鉴定出乳样所含致病菌的具体种类。
1 材料与准备
1.1 主要材料与试剂
50 mL/L绵羊红细胞琼脂板，CMT试剂，兔血浆，七叶苷药敏片(Esculin片)，灭菌蒸馏水，无水乙醇，β溶血性金黄色葡萄球菌，无乳链球菌(用于CAMP试验)。
1.2 七叶苷药敏片的制备
首先是制备灭菌圆纸片，采用直径为6 mm的纸片作抗生素药敏试验，用铝箔包裹，灭菌器灭菌(121 ℃，15 min)。其次是配置药液，蒸馏水100 mL、蛋白胨1 g、氯化钠0.5 g、七叶苷0.1 g、柠檬酸铁0.05 g，煮沸2次以完全溶解，置灭菌器灭菌15 min。最后将灭菌过的圆纸片置入灭菌的玻璃皿中，溶液倾至器皿中，弃去多余液体，用干热灭菌器烘干(55 ℃，2 d)，取出制备的药敏片放入冰箱备用[3]。
2 菌种鉴定试验方法及原理
2.1 菌落特征
葡萄球菌为中等大小、清晰白色或黄色菌落，链球菌为小型、无色、湿润、隆起、半透明菌落[4-5]。葡萄球菌有4种溶血类型，即完全溶血，不完全溶血，双重溶血和不溶血。链球菌有3种溶血类型，即绿色溶血，完全溶血和不溶血。
2.2 革兰氏染色特征
葡萄球菌镜检所见类似于葡萄串状蓝色球状菌，链球菌呈长链或短链蓝色的球状或卵圆形；大肠埃希菌菌体呈红色短杆状，牛棒状杆菌菌体呈红色棒状[6-7]。
2.3 接触酶试验
用于链球菌和葡萄球菌的区分。在载玻片上滴一滴30 mL/L过氧化氢液，挑取单个菌落在过氧化氢液中搅匀。阳性者产生气泡，阴性者无反应[8-9]。
2.4 氢氧化钾试验
用于葡萄球菌和大肠埃希菌的区分。在载玻片上滴1滴30 g/L KOH溶液，挑取细菌菌落与之混合均匀，大肠埃希菌混合液在5 s～30 s内会变成黏稠状。阳性者混合物变成黏稠状或胶胨样，阴性者混合物仍然保持液状。
2.5 CAMP-Esculin test
鉴定链球菌，需要用CAMP试验对所有链球菌的菌落进行检查。将β溶血性金黄色葡萄球菌中央划线接种于50 mL/L绵羊红细胞琼脂板，挑取琼脂板上的1个～2个菌落，在β溶血性金黄色葡萄球菌接种线5 mm外垂直划线。每次试验均应包括已知的无乳链球菌培养物，作为CAMP阳性对照[3,10-11]。
如果CAMP试验阳性，再将Esculin片放至接种划线的中间区域，30 min后观察结果。如果Esculin片中心的颜色由白色变成黑色或棕色，则为Esculin阳性。CAMP阳性、Esculin水解阴性的，是无乳链球菌(SAG)，其他反应则是其他链球菌(OS)。
CAMP阳性：箭头状的完全β溶血，是由金黄色葡萄球菌产生的溶血区域。
CAMP阴性：无反应。
Esculin水解阳性：颜色由白变成黑色或棕色。
Esculin水解阴性：无反应(保持白色不变)。
2.6 凝固酶试验
凝固酶试验用于区分金黄色葡萄球菌和其他葡萄球菌[8]。将0.5 mL含凝固酶的兔血浆连同24 h培养的葡萄球菌平板培养物接入试管中，将试管放入37 ℃培养箱培养24 h。阳性者轻轻扣击试管，就可出现凝固现象。阴性者培养24 h后，仍然呈液体状态。