摘要 目的: 建立血浆中白藜芦醇苷的反相高效液相色谱分析方法, 并对其在苗猪体内的药代动力学进行研究。方法: 采用Hypersil ODS 色谱柱(100 mm ×2.1 mm , 5μm) , 甲醇- 水(25∶75) 为流动相, 流速1.0 mL/min, 检测波长290nm。结果: 方法平均回收率为93.3 %～98.1 % , RSD < 6.0 % , 线性范围0.39～12.50 mg·L - 1 ( r = 0.994 7) , 最低检测浓度为0120 mg·L - 1 。结论: 本试验首次建立了白藜芦醇苷血药浓度的HPLC 测定方法, 操作方便, 结果准确, 可用于该药的进一步临床药动学研究。
关键词 白藜芦醇苷 虎杖 药动学 高效液相色谱
1 试药与仪器
藜芦醇苷对照品, 纯度> 96 % (复旦大学药学院天然药物化学教研室) , 虎杖注射液(上海市曙光医院药剂科, 批号981106 , 规格为每支5mL , 含生药5 g , 含白藜芦醇苷40 mg) 。甲醇为色谱纯, 水为重蒸馏水, 三氯乙酸为分析纯。
HP1100 系列高效液相色谱仪, TGL-16G 高速台式离心机, CQ50 超声波清洗器, A200S 电子天平, Bear - 1000 型电动定容呼吸机, HP78353B型生理四导测压仪。
2实验方法
2.1 色谱条件[3 ] ：色谱柱Hypersil ODS 柱(100mm ×2.1 mm , 5 μm) ; 流动相为甲醇- 水(25∶75) , 使用前用滤膜减压过滤, 超声除气; 流速1.0 mL·min - 1 ; 检测波长290 nm。
2.2 白藜芦醇苷对照品溶液的配制：精密称取白藜芦醇苷对照品适量, 加甲醇溶解并用流动相定容至10 mL , 即得浓度为0.125 mg·mL - 1的对照品溶液。再吸取对照品溶液1 mL , 并用流动相定容至10 mL , 即得浓度为0.012 5 mg·mL - 1的对照品溶液。
2.3 样品采集
健康苗猪5 只, 雌雄不限, 体重( 8.46 ±1.06) kg , 由上海第二医科大学附属新华医院实验动物中心提供。
5 只苗猪于试验前24 h 禁食, 试验日晨将猪常规麻醉后行气管切开插管术, 接呼吸机, 吸入氧浓度约为30 % , 使血气分析保持正常; 经右侧颈外静脉插入5F Swan - Ganz 四腔漂浮导管至肺动脉,连接生理四导测压仪, 监测肺动脉压( PAP) 。经右股动脉插入导管以监测动脉血压(ABP) 及测血气分析, 经由股静脉采血。首先进行低氧通气30min , 建立缺氧性肺动脉高压模型; 然后将实验动物用虎杖注射液1.5 g·kg - 1加生理盐水稀释至20mL , 用静脉输液微泵静脉推注10 min , 于推药前及推药后15 , 30 , 60 , 90 , 120 , 180 , 240 , 300min 测定肺动脉压力并采血2 mL , 肝素抗凝,3 000 r·min - 1离心5 min , 分离血浆, 置于- 20 ℃冰箱中冷冻待测。
2.4 样品预处理：取肝素抗凝血浆1.0 mL , 加入10 %三氯乙酸0.4 mL , 振荡1 min , 3 000 r·min - 1离心5 min , 取上清液20μL 进样。
3 结果
3.1 色谱行为：图1 分别为空白血浆、空白血浆中加入白藜芦醇苷对照品及静注虎杖注射液后的血浆样品得到的色谱图。从图可知, 白藜芦醇苷与血浆内源峰分离良好, 在此色谱条件下, 白藜芦醇苷的保留时间为11.4 min。
3.2 线性范围 在每1 mL 空白血浆中分别加入浓度为0.012 5 mg·mL - 1的白藜芦醇苷对照品溶液7.8 , 15.5 , 31 , 62 μL 及浓度为0.125 mg·mL - 1的白藜芦醇苷对照品溶液12.4 , 24.8 , 49.6 ,99.2μL , 使血浆浓度分别为0.10 , 0.20 , 0.39 ,0.78 , 1.56 , 3.12 , 6.25 , 12.50 mg ·L - 1 , 按“样品预处理”项下操作, 测得的峰面积A 与进样浓度C (mg·L - 1) 作回归曲线, 重复3 次, 得回归方程为:A = 20.00 C – 12.10 r = 0.994 7线性范围为0.39～12.50 mg·L - 1 , 最低检测浓度为0.20 mg·L - 1 。
3.4 回收率及精密度
在每1 mL 空白血浆中分别加入浓度为0.125mg·mL - 1 的白藜芦醇苷对照品溶液6.2 , 24.8 ,99.2μL , 使血浆浓度分别配制成低( 0.78 mg·L - 1) 、中(3.12 mg·L - 1 ) 、高(12.50 mg·L - 1 )3 种浓度数份, 按“样品预处理”项下操作, 用其峰面积与用流动相配制的相应对照品溶液直接进样得到的峰面积进行比较, 测定方法的绝对回收率,其结果( n = 5 ) 分别为94.35 % , 95.74 % ,98.10 % , RSD 分别为4.2 % , 3.9 % , 2.7 %。
按同样方法配制出上述高、中、低3 种浓度的血浆样品后, 按“样品预处理”项下操作, 计算样品峰面积, 求算日内及日间( n = 5) 精密度。
3.5 药代动力学研究 按照“样品采集”和“样品预处理”项下操作, 对小猪静注虎杖注射液后,白藜芦醇苷的猪体内的药代动力学进行研究。采用PK- GRAPH 药代动力学程序(上海第二医科大学药理教研室尹忠铭编制) 处理, 选择权重系数为1/ C , 药代过程选用二房室模型。其平均药- 时曲线见图2 。
4 讨论
4.1 本文建立了高效液相色谱法测定血浆中白藜芦醇苷的血药浓度。考察得出的回收率和日内、日间的精密度均符合临床血药浓度监测要求。在建立方法的过程中, 对血浆蛋白沉淀剂的选择, 我们曾比较了甲醇、乙醇和10 %三氯乙酸, 在采血量偏小的情况下, 采用10 %三氯乙酸作蛋白沉淀剂,药物回收率高, 血浆蛋白干扰较小。
4.2 对流动相的选择, 我们曾先后尝试了甲醇-水从高到低的不同比例, 结果在甲醇- 水(25∶75)时白藜芦醇苷峰形良好, 保留时间适中, 血浆内源成分峰无干扰。
4.3 利用本方法对白藜芦醇苷在苗猪体内的药代动力学进行了研究, 结果表明静注虎杖注射液后血浆药- 时曲线成二房室模型, 消除半衰期较短,t1/ 2β= (1.86 ±0.32) h , 连续给药不易引起药物蓄积; 同时, 在试验测定的浓度范围内(0.66～3.10 mg·L - 1) , 苗猪无1 例出现心律失常、心率加快、血压下降等副作用, 考虑因试验用药量(9.40 mg·kg - 1) 远远低于文献报道的最低中毒剂量(50 mg·kg - 1) [4 ] 。在试验中, 我们观察了5 例苗猪用药后5 h 内其肺动脉压力及其血药浓度变化, 结果5 例猪在第5 h 测得的平均血药浓度已降至0.66 mg·L - 1 (其中1 例因浓度太低而无法测出) , 且该5 例猪在5 h 内的肺动脉压力一直持续较用药前下降, 可见该药物的治疗浓度范围远远低于中毒浓度, 从而说明该药有较高的用药安全性。但因观察例数较少, 仅为其进一步研究提供参考。