摘要 建立测定家兔血浆中左旋氨氯地平浓度的RP2HPLC 分析方法, 并对其在家兔体内的药代动力学进行研究。将血浆样品在碱化条件下经乙醚提取, 用KromasilC18 (150mm ×4.6mm , 5 um) 反相柱, 甲醇-水(42∶58, 内含三乙胺0.1 % ) 为流动相, 流速为1.0m l/m in, 检测波长238 nm 等条件下, 分析测定。结果发现: 平均回收率为94.32%～ 98.46% , RSD< 7.0% , 线性范围: 1.0～ 50.0 ng/m l ( r= 0.9992) , 最低检测限可达0.1 ng。结果提示: RP-HPLC法操作简便、准确灵敏、重现性好, 可用于左旋氨氯地平的药代动力学研究。
关键词 左旋氨氯地平; 药代动力学; 色谱法, 高效液相
氨氯地平(am lodip ine) 为新型长效的二氢吡啶类钙拮抗剂药物, 临床上主要应用于治疗高血压和心绞痛。消旋苯磺酸氨氯地平的商品名为洛活喜(novrase) , 但R - (+ ) -氨氯地平与S - (- ) -氨氯地平并不具有相同的生物活性, 仅仅S - (- ) -氨氯地平产生血管扩张作用[ 1 ]。氨氯地平的体内分析方法主要有气相色谱法[ 2 ]和高效液相色谱法[ 3 ]。有关消旋苯磺酸氨氯地平的药代动力学研究, 目前国内文献已有多篇报道[ 4, 5 ] , 但未见有S - (- ) -氨氯地平的药代动力学测定结果。本实验对左旋氨氯地平的提取方法及高效液相色谱条件进行了研究, 建立了一种反相高效液相色谱(RP-HPLC) 方法, 用于对家兔血浆中左旋氨氯地平浓度的分析测定, 并对其在家兔体内的药代动力学进行研究。
1 材料与方法
1.1 实验材料
左旋苯磺酸氨氯地平样品由辉瑞制药有限公司提供, 左旋苯磺酸氨氯地平标准对照品由辉瑞制药有限公司提供的样品精制而得, RP-HPLC 测定为一单峰。甲醇、乙醚、氢氧化钠等实验试剂均为国产分析纯, 水为二次蒸馏水。
1.2 实验动物
新西兰种大白兔, 雌雄兼用, 体重(2.2 ±2.6) kg, 购自三峡大学医学院实验动物养殖场。
1.3 分析仪器
Gilson 系列高效液相色谱仪, 岛津C-R6A 色谱数据处理机, Rheodyne 7125 六通进样阀, 配有50ul定量管。XW -80 涡旋混合器(上海医科大学仪器厂) , 80-2 离心沉淀器(上海手术器械厂)。
1.4 给药方法与血样采集
取健康家兔6 只, 雌雄不限, 体重(2.4 ±0.2) kg。另取左旋苯磺酸氨氯地平适量混悬于生理盐水中, 按5 mgök g 的剂量灌胃给药。于灌胃前及灌胃后0.5、1、1.5、2、2.5、3、4、6、8、10、12、24 h 耳动脉采血2 m l, 肝素抗凝, 3000 r/m in 离心制成血浆。
1.5 血浆样品预处理
取血浆1.0 m l, 加入2.5 molöL N aOH 100 ul,混匀, 再加入乙醚5m l, 振荡提取5m in, 4000 r/m in离心5m in。取醚层提取液4.0m l, 40℃恒温水浴下通氮气吹干, 残渣加100 ul 流动相溶解, 振荡3m in, 15 000 r/m in 离心10m in。精密吸取上清液50ul 进样分析, 用外标法计算。
1.6 色谱分离条件
分析柱: Kromasil C18 (150 mm ×4.6 mm , 5um) , 流动相: 甲醇-水(42∶58, 内含三乙胺0.1% ) , 紫外检测波长238 nm (01005 aufs) , 柱温控制在25℃, 流速为1.0 m l/m in。
1.7 血浆标准曲线的制备
精密称取左旋苯磺酸氨氯地平标准对照品一定量, 用甲醇溶解并稀释定容至10 m l, 配制成1.0ug/m l 的标准溶液。从左旋苯磺酸氨氯地平标准溶液中精密吸取相当于1.0、2.0、510、10.0、20.0 和50.0 ng 的左旋苯磺酸氨氯地平溶液置于6 个具塞磨口离心管中, 通氮吹干后各加入空白血浆1.0m l, 配制成含左旋苯磺酸氨氯地平1.0、2.0、5.0、10.0、20.0 和50.0 ng/ml 的标准血浆样品。按上述血浆样品预处理方法操作, 并进样分析。图1 为空白血浆及实测血浆样品的RP-HPLC 典型谱图, 显然血浆中内源性物质均不干扰体内左旋氨氯地平的含量测定, 其中保留时间tR 7.947 m in 为左旋氨氯地平色谱峰。以左旋苯磺酸氨氯地平标准对照品峰高(H , Y ) 对相应的浓度(C, ng/m l) 进行线性回归, 左旋苯磺酸氨氯地平血浆标准曲线方程为: Y =30.72+ 36.03C, r= 0.9992 (n= 5) , 线性范围为1.0～ 50.0 ng/m l。以信噪比S/N = 2 计算, 本法测定的血浆中苯磺酸左旋氨氯地平最低检测限可达0.1 ng。
1.8 方法回收率和精密度
按血浆标准曲线测定方法配制2.0、10.0、50.0ng/m l 低、中、高3 种浓度的左旋苯磺酸氨氯地平标准血浆样品各5 份, 经血浆样品预处理后进样分析,测得3 种浓度的方法回收率分别为( 94.32 ±5.48)% 、(98.46±4.16)% 和(96.81±4.40)%。同法配制2.0、10.0、50.0 ng/m l 低、中、高3 种浓度的左旋苯磺酸氨氯地平标准血浆样品, 进行日内日间精密度试验, 结果3 种浓度的左旋苯磺酸氨氯地平标准血浆样品日内相对标准差RSD 分别为5.82%、4.22% 和4.54% , 日间RSD 分别为6.93%、5.20% 和4.78% 。
2 结果
6 只健康家兔按5 mg/kg 剂量一次灌胃左旋苯磺酸氨氯地平后, 体内平均血药浓度-时间曲线见图2。血药浓度数据采用3P87 程序经计算机自动迭代拟合, 以实测值与理论值比较及A IC 值判别, 结果显示左旋苯磺酸氨氯地平在家兔体内的药代动力学过程呈一级吸收的二房室开放模型。以统计矩方法计算得到的主要药代动力学参数tmax、Cmax、t1/2、MRT、Cl/F 和AU C0～ ∞ 分别为( 3.2 ± 0.5) h、(26.33±2.36) ng/m l、(5.85±1.76) h、(6.45±2.27) h、(25.44±3.63) L/(kg·h)、(19715±28.23) ng·h /m l。
3 讨论
左旋氨氯地平属弱碱性药物, 采用液-液萃取法提取血浆中的左旋氨氯地平, 应特别注意提取介质酸碱度的控制。酸性条件下左旋氨氯地平易成盐不利于有机溶剂提取, 而且血浆蛋白干扰严重, 影响色谱分离。本文在血浆1.0 m l 中加入2.5 mol/LN aOH 100ul 控制提取介质的pH 值, 使左旋氨氯地平以分子形式存在, 既保证了提取效率, 又减少了血浆蛋白的干扰。对于提取溶剂选择, 本实验考察了乙酸乙酯、乙醚、正己烷、环己烷及二种溶剂的混合液, 结果发现乙醚对左旋氨氯地平提取效率最高, 只是在涡旋震荡提取时易乳化, 故考虑在提取操作时应加入适量N aCl, 防止样品液乳化。
本实验建立的RP-HPLC 方法准确、灵敏、专一, 可满足对左旋氨氯地平血药浓度分析的要求。利用本法对左旋苯磺酸氨氯地平在家兔体内的药代动力学进行了研究, 家兔以5mgökg 剂量一次灌胃左旋苯磺酸氨氯地平后血药浓度变化经3P87 程序处理, 体内过程符合一级吸收的二房室开放模型, 同时主要药代动力学参数选择统计矩方法以实测数据计算可以真实地反映左旋苯磺酸氨氯地平在家兔体内的动态处置过程。
