摘 要:本文对近年来化学发光联用技术在兽药残留分析中的应用进展进行了评述,主要包括化学发光免疫分析、分子印迹2化学发光分析、微流控芯片2化学发光检测等,引用文献31篇。
关键词:化学发光分析;兽药残留分析;联用技术;评述
1 引言
兽药对改善动物的生存条件、降低动物的发病率和死亡率及促进养殖业增产等具有极其重要的作用,是当前养殖业不可缺少的物质基础。但由于科学用药知识的缺乏和经济利益的驱使,滥用兽药和非法使用禁用兽药,致使少量的药物原体、有毒代谢物、降解物及杂质等残留在动物的肉和各种组织中,即兽药残留(Animal Drug Residues) ,它已严重威胁着人们的身体健康和生命安全。进食不安全已成为全世界关注的焦点问题之一,如雌激素、喹恶啉类、硝基呋喃类、硝基咪唑类等兽药残留都已证明有“三致”作用。因此,世界各国都高度重视食品安全,采取各种措施限制乃至禁止某些兽药的使用,并采用最先进的技术和方法加强动物性食品中的兽药残留检测。
我国作为动物性食品的生产和消费大国,如何提高产品的品质,减少药物残留,已成为养殖业乃至整个农业发展亟待解决的问题。因此,研究兽药残留的高灵敏的检测方法,既是保证动物性食品的安全,也是我国养殖业适应市场国际化的要求、避免贸易争端所必需采取的措施。近年来化学发光联用技术在兽药残留分析领域中的应用十分引人注目。本文就其应用进展作一简要综述。
2 化学发光分析法的特点
化学发光分析法(Chemiluminescence , CL) 是借助于化学发光现象,基于化学发光强度和被测物含量之间的关系建立起来的一种分析方法,它无需光源和色散装置等复杂设备,因而避免了光源不稳定性和光学分析中常见的散射光、杂散光等的干扰,检测背景低,具有灵敏度高(10 - 10 ～10 - 21 mol/ L) 、线性范围宽(3～6 数量级) 、设备简单、分析快速等优点;化学发光分析还具有所谓的“化学谱带变窄”效应,它是由化学发光反应的动力学速度很快引起的,即样品还未充分扩散到本体溶液前就已产生化学发光信号,因此很适合于在线快速检测,且记录的信号峰尖锐,不会造成明显的区带展宽。
化学发光分析测定的物质可以分为三类:第一类物质是化学发光反应中的反应物;第二类物质是化学发光反应中的催化剂、增敏剂或抑制剂;第三类物质是偶合反应中的反应物、催化剂、增敏剂等。而这三类物质还可以通过标记等方式用来测定人们感兴趣的其它物质。化学发光分析测定物质的方式可分为直接法和间接法,并通过与其它分析技术联用,进一步扩大了应用范围。
广义的化学发光包括电致化学发光( Elet rogenerated Chemiluminescence , ECL) ,它是指在电极表面附近发生电极反应或电极反应产物进一步发生化学反应产生发光现象,集化学发光分析法和电化学分析法的优点于一体,因此,近年来受到广泛的关注。
化学发光分析用于兽药残留检测的方式通常有两种:一是根据化学发光反应,或采用直接法(直接检测残留物) ,或采用间接法(残留物增强或抑制化学发光反应、残留物与发光反应偶合、酶联免疫化学发光法等) 检测兽药残留。常用的发光试剂有鲁米诺类(Luminol ) 、联吡啶钌( Ⅱ) 配合物( Ru ( bipy) 2 +3 、Ru (p hen) 2 +3 ) 、过氧草酸盐类( Peroxalate) 、吖啶衍生物(Acirdinium) 、二氧环乙烷类和洛粉碱类等,其中以鲁米诺类和联吡啶钌类化学发光体系应用最为广泛;二是化学发光作为检测器与其它技术联用,如化学发光还可与高效液相色谱( HPLC) 联用,或者与固相萃取结合,实现残留物的在线检测。
化学发光作为兽药残留检测技术有三大优势:一是化学发光分析方法本身的超高灵敏度,零背景干扰;二是残留的兽药小分子(包括残留标志物) 通常是含有- C = C - 、- C = O、- N = N - 、- N = O、- P = O 等官能团及苯环或多元杂环的化合物,易于成为化学发光分析检测的对象;三是发光试剂可通过电化学的方法循环使用(电化学发光) ,如钌( Ⅱ) 联吡啶(Ru ( bipy) 2 +3 ) 体系。屈颖娟等基于盐酸克伦特罗(Clenbuterol ,CLB) ,俗称“瘦肉精”对Ru (bipy) 2 +3 电化学发光信号有较强的增敏作用,建立了一种高灵敏测定盐酸克伦特罗的电化学发光分析法,他们还将此电化学发光检测器和紫外检测器两者的检出限作了对比,结果表明前者的检出限比后者降低了2 个数量级。
另外,化学发光由于不需要光源,其检测系统比激光诱导荧光更易微型化、集成化,非常适合作为微流控芯片的检测器。
3 化学发光分析法在兽药残留分析中的应用
3. 1 化学发光免疫分析法
化学发光免疫分析法(Chemiluminscent Immunoassay ,CL IA) 是根据放射免疫分析(RIA) 的基本原理,将高度灵敏的化学发光与高度特异的免疫分析法相结合建立起来的一种高效非放射性检测手段。它是将发光物质或酶标记在抗原或抗体上,免疫反应结束后,加入氧化剂或酶底物而发光,通过测量发光强度,根据标准曲线测定待测物的浓度。CL IA 主要的优点是:
(1) 高灵敏度,由于不需要外来光源,具有比荧光法更高的信噪比,最低可以检测到100 个分子(10 - 21mol) ,灵敏度比RIA 或EA (酶免疫分析技术) 高1 至2 个数量级;
(2) 发光标记物稳定,有效期长达数月甚至数年;
(3) 检测范围宽,可达6 个数量级;
(4) 自动化程度高,避免了手工操作带来的误差,提高了分析方法的精密度。近年来CLIA 发展迅猛,已经成为一种成熟的、先进的痕量/ 超痕量物质检测技术,是目前发展和推广应用最快的免疫分析方法之一。
化学发光免疫分析根据标记物不同,可分为标记化学发光物质的化学发光免疫分析、标记酶的化学发光酶免疫分析和电化学发光免疫分析三大类。下面以化学发光酶免疫分析法(Chemiluminescent Enzyme Immunoassay ,CL EIA) 为例说明其在兽药残留分析中的应用。由于兽药残留多是小分子化合物,在进行免疫分析检测时一般先要获得兽药的抗体(通常可将兽药小分子以半抗原形式,通过一定长度的碳链连接分子与分子量大的载体(如蛋白质) 以共价键耦联制成人工抗原,再进行免疫即获得兽药抗体) ,接着蛋白偶联的兽药(即合成的人工抗原) 与被检物中的兽药竞争性地与兽药抗体结合,发生抗原、抗体免疫反应,再通过化学发光进行检测。胥传来等采用间接竞争CL EIA 对猪尿样中的盐酸克伦特罗进行了检测,与酶联免疫吸附分析法( EL ISA) 相比,EL ISA 虽然操作简单、快速,但其检出限一般只有0. 1μg/ L 左右,难以达到检测要求,且通常还需要进一步采用气相色谱2质谱( GC2MS) 或液相色谱2质谱(LC2MS) 等方法进行确证。而采用CL EIA 检测盐酸克伦特罗的灵敏度可达到0. 01μg/ L ,其线性范围为0. 04～25. 8μg/ L 。因此,CL EIA 比EL ISA 具有更高的灵敏度。
3. 2 高效液相色谱2化学发光检测法
高效液相色谱法( HPLC) 是20 世纪70 年代发展起来的一种高效、快速分离分析技术。目前HPLC使用的检测器主要是紫外吸收检测器(UV) 和荧光检测器(FD) 。UV 检测器只能检测对紫外光有吸收的物质,且灵敏度低; FD 检测器的灵敏度较UV 高,但多数兽药残留分子本身不发射荧光,需要经过复杂繁琐的衍生化反应。化学发光/ 电化学发光(CL/ ECL) 作为HPLC 的检测器( HPLC2CL/ ECL) 已成为一种有效的痕量或超痕量检测技术。Suzuki等采用HPLC2ECL 对鸡肉组织中的氧氟沙星进行了分析,检出限达10 ng/ g。Wan 等依据土霉素、四环素和美他环素三种抗生素增强KMnO42Na2SO3-β-环糊精体系化学发光的原理,建立了三种抗生素的HPLC2CL 分析法,检出限分别为0. 9 ng/ mL 、3. 0 ng/ mL 和5. 0 ng/ mL 。Katayama 等[15 ] 采用HPLC2CL 对血清中免疫抑制剂药物环孢菌素A 进行分析,检出限达到5. 0 ×10 - 9 mol/ L 。
3. 3 分子印迹2化学发光法
分子印迹技术(Molecular Imprinting ,MIP) 是根据抗体2抗原或酶与底物的特异性识别原理建立起来的一种分离技术,其核心是获得在空间结构和结合位点上与某一分子(模板分子) 相匹配的聚合物,这是一类具有独特分子识别能力的新型分离介质,被誉为“塑料抗体”。分子印迹聚合物(MIPs) 制备过程可分为三步:首先被印迹的分子与聚合物单体键合;其次是选择适当的交联剂将聚合物单体交联起来形成共聚合物;最后再通过一定的方法将印迹分子从聚合物中提取出来,从而得到MIPs。由于MIPs 留下了目标分子的“印迹”或“记忆”,因此它对目标分子表现出特异的选择性和结合能力,能够从复杂样品中选择性地识别和捕获印迹分子或同印迹分子结构相近的某一族或某一类化合物。MIPs 识别目标分子的能力不仅可与抗体-抗原、酶-底物、受体2激素间的特异性识别相媲美,而且还具有抗体、酶、受体等所不具备的对特殊环境(如高温、高压、强酸、强碱、强离子强度等) 的耐受性和长寿命。
将分子印迹与化学发光联用(分子印迹2化学发光) ,一方面可利用化学发光检测技术的高灵敏度;另一方面可结合分子印迹分离技术的预见性、识别性和实用性,弥补了化学发光分析选择性较差的不足。二者的结合为化学发光分析法用于兽药残留分析提供了一种新的思路。杜建修等以扑热息痛( Paracetamol) 为目标分子,丙烯酰胺为功能单体,乙二醇二甲基丙烯酸酯为交联剂,采用分子印迹技术合成了对扑热息痛具有选择性识别能力的扑热息痛分子印迹聚合物,并将此聚合物颗粒填充在化学发光流通池中作为分离富集介质。当扑热息痛溶液流过流通池时,目标物被印迹聚合物选择性俘获,再与流过的铁氰化钾和鲁米诺的混合液发生偶合化学发光,而导致体系的化学发光信号降低。结果表明,该方法对扑热息痛的检出限为3 ×10 - 6 mol/ L ,并成功地用于尿样中扑热息能的分析。该课题组还采用类似的方法,建立了安乃近的分子印迹-化学发光分析法,检出限达4 ×10 - 8 mol/ L 。Zhou 等将克伦特罗分子印迹聚合物装在流通池中作化学发光传感器在线富集克伦特罗,不仅显著地提高了克伦特罗检测的灵敏度和选择性,而且避免了克伦特罗在化学发光检测中的严重基质干扰。另外,分子印迹技术还可以与固相萃取(SPE) 结合,制备分子印迹2固相萃取柱(MISPE) ,解决了常规SPE 中吸附剂与被萃取物之间作用力是非特异性结合的问题。MISPE 不仅可以离线制备,还可以在线原位合成。原位法比离线法制备的MISPE 整体柱具有更好的多孔性、渗透性和稳定性,邹汉法等已证明原位MISPE 的柱效远高于离线MISPE 的柱效。MISPE 可用于分离和富集动物性食品中的残留兽药,既能用于单个兽药的残留分离,也能用于多残留的筛选。而采用原位聚合法直接在色谱柱内合成MISPE 整体柱,结合化学发光在线检测,更显示分子印迹技术在兽药残留分析中的广阔应用空间。
因此,分子印迹2化学发光将成为兽药残留分析领域的重要研究方向之一。
3. 4 毛细管电泳2化学发光法
毛细管电泳(Capillary Elect rop horesis ,CE) ,又称高效毛细管电泳( HPCE) ) ,它是20 世纪80 年代兴起的一种新型、高效分离技术,是近年来发展最快的分析化学研究领域之一。它是以电场力为驱动力,以毛细管为分离通道,根据样品中待测物或其离子间淌度和分离行为上的差异,而实现分离的一种液相分离技术。在毛细管电泳分析中,检测器灵敏度是CE 的关键。迄今为止,除了原子吸收和红外光谱未用于CE 的检测外,其它检测手段均已用于CE ,而其中CL/ ECL 检测技术最引人注目。Tsukagoshi 等证明用CE-CL 检测血红蛋白的检出限比CE-UV 降低4 个数量级。汪尔康课题组对Ru ( bipy) 2 +3 的ECL 与CE 联用进行了系统的研究,与西安瑞迈公司合作研制出了CE-ECL 仪,并已成功地用于临床药物分析。
近几年发表的有关CE-CL/ ECL 的文章数量呈快速增长之势,充分显示出CE-CL/ ECL 在分析检测领域中的巨大应用潜力。
3. 5 微流控芯片化学发光检测技术
微流控芯片是将整个化验室的功能,从样品制备到分离、检测的整个分析过程都集成在一个只有几平方厘米的芯片上进行,其显著优点是:
(1) 试剂消耗大大减少到微升甚至纳升、皮升级,从而降低了分析成本,减少了对环境的污染;
(2) 分析速度快;
(3) 应用范围广泛(从原则上讲,它适合于从核酸、蛋白质大分子到有机、无机等小分子的检测) ;
(4) 携带方便,为分析测试技术的普及创造了条件。
在微流控芯片中,最被看好的高灵敏度检测技术主要包括电化学、激光诱导荧光、生物和化学发光技术,而其中的ECL 由于兼有电化学和化学发光技术的优点而更具优势。CL/ ECL 与微流控芯片联用是当前化学发光分析研究的一个新热点。Zhao 等[以Indium Tin Oxide ( ITO) 作工作电极,采用微芯片CE-ECL 系统对尿样中的林肯霉素(Lincomycin) 进行了检测,整个分析过程可在40 s 完成,检出限达9. 0 ×10 - 6 mol/ L 。这种方法可以直接用于尿液中林肯霉素的检测,无需前处理,为临床和制药领域林肯霉素的检测提供了一种全新的方法。Greenwood 等首次采用化学发光-微全分析系统(Micro Total Analysis Systems ,即μTAS) ,以Ru ( bipy) 2 +3-Ce ( Ⅳ) 为化学发光体系,通过副压泵系统进样,对药物分子阿托品(At ropine) 和派鱼替啶( Pet hidine) 进行了分析,检出限分别为3. 8 ×10 - 9 和7. 7 ×10 - 8 mol/ L 。μTAS 芯片与化学发光检测联用有极好的应用前景。
微流控芯片的集成化、微型化和自动化等特点符合兽药残留分析发展的要求,因此,开展这一新技术在兽药残留分析领域的研究,不仅可以为我国动物性食品安全监测和控制提供新的技术支持,而且对推动微流控芯片分析技术在兽药残留分析领域中的应用也具有十分重要的意义。
4 结论
目前,发达国家在兽药残留分析方面呈现两大趋势:一是残留指标限量值的逐步降低;二是检测技术趋向于高技术化、系列化、速测化、便携化。因此,化学发光联用技术在兽药残留检测领域中的研究和应用具有广阔的空间,而微流控芯片与化学发光检测技术联用将是其中最具应用潜力的研究方向。随着微流控芯片分析技术不断开发和完善,将催生出新一代既具有当今实验室大型分析仪器的分析性能,又具有使用方便、检测快速、价格低廉的食品安全检测方法和仪器。