摘要：为了确证牛奶中土霉素、四环素、金霉素的残留，建立了电喷雾高效液相色谱／串联质谱法．采用正离子检测，选择离子方式扫描。牛奶样品经Mcllvame—EDTA缓冲容液提取离心后，上清波过C18，小柱净化后甲醇洗脱，然后氮气吹干，甲醇—水(30：70)溶解(以去甲金霉素为内标)后进行分析。结果表明，牛奶中土霉素、四环素和金霉素的检测限(LODs)为0.0lmg／L，定量限(LOQs)为0.025mg/L。3种药物在0.05一O.5mg几范围内均呈良好线性关系，并且3个添加浓度的平均回收率范围为70.0％～87.6％，批内变异系数不大于10％，以最大残留限量浓度添加后所测得回收率的批间变异系数小于15％。本方法特异性强、灵敏度高、准确可靠，可作为牛奶及其他动物组织中四环素类药物残留的确证方法。
四环素类抗生索主要包括土霉素(OTC)、四环素(TC)和金霉素(CTC)，目前常用于预防和治疗动物疾病。但是如果不合理地使用该类药物，如用药剂量过大、用药时间过长、滥用药物以及不遵守休药期提前屠宰等都会使该类药物残留于动物组织及牛奶中。为了有效地预防四环素类药物的滥用，欧盟、日本和美国等都制定了动物组织及牛奶中的最大残留限量，其中规定在牛奶中的最大残留限量为0.1 mg／L[1]，我国农业部也明确规定四环素类药物在牛奶中的最大残留限量为100ug／kg[2]；。目前用于检测牛奶中四环素类药物残留的方法主要有微生物方法和酶联免疫方法，但是由于这2种方法缺乏特异性，仅能作为筛选方法，因此，非常有必要建立一种确证方法。带有子离子检测的液质串联质谱(LC／MS／MS)作为一种敏感、高效、特异的分析方法较适于作为四环素类药物的确证方法。虽然四环素类药物的液质联用法已有文献[3-4]报道，但是由于其检测限和定量限苦遍偏高，而且不适于检测牛奶中的四环素类药物残留，因此本试验建立了一种特异性强、灵敏度高的检测方法用于该类药物的确证。
1 材料与方法
1．1 仪器 质谱仪为英国Micromass公司Quattro MicroTM质谱仪，包括ESI(电喷雾电离)及Masslynx数据处理系统；液相色谱仪为Waters Alliance 2690 HPLC系统。色谱柱为Waters symmetry C18柱(5um，2.1X 150 mm I. D．)；RIDAC18小柱(100 g/L，r—biopharm公司)。
1．2 药品与试剂 四环素、土霉素、金霉素对照品及内标物去甲金霉素均由SIGMA公司提供，分别用甲醇配成1 g／L的储备液，有效期1个月。甲醇、乙腈均为HPLC级；甲酸，柠檬酸、磷酸氢二钠、乙二胺四乙酸二钠、盐酸均为分析纯；所用水为重蒸水；牛奶样品采自不喂食四环素类药物的健康奶牛。
1. 3 液相色谱—质谱分析条件 流动相为乙腈—水(甲酸含量0.3％)，采用梯度程序进行分析(表1)，流速为0.2 mL/min。柱温为(20±5)C。毛细管电压2.5 kV，锥孔电压25～32 V，碰撞能量14～23 eV(表2)，离子源源温为80℃。雾化温度200C。碰撞气(氩气）流速为310L／h，辅助气(氮气)流速为51L/h。采用正离子检测，选择离子方式扫描。
1．4 标准曲践的制备 取2 mL牛奶样品，分别加入敬：霉素、四环素和金霉素的混合标准溶液(质量浓度分别为5、10、15、20、25、30、50mg／L。)20uL，加入Mcllvalne—EDTA溶液8nd。(一水柠檬酸11.8g士二水磷酸氢二钠27.6g十二水乙二胺四乙酸二钠37.2 8，溶于1 L水中，盐酸调pH至3.8)，旋涡混匀，静置5 min，然后中速震荡30 min，取出后于l0 000r／min离心10 min，取5 mL。上清液过C18小柱(先用3 mL甲醇，2mL水预洗)，用1 mL。水洗涤小柱并挤于，最后用2 mL甲醇洗脱，洗脱液经氮气吹干后用l mL甲醇—水(浓度比为30：70，井含有0.1mg／L的内标物)溶解，取20uL。进行LC／MS／MS测定，以待测物与内标的峰面积比为纵坐标，待测物浓度为横坐标进行线性回归分析，得到标准曲线。
1．5 添加回收率的测定 根据欧盟委员会决议2002／657／EC，用最大残留限量(MRLs)、最大残留限量的半量以及二倍残留限量的浓度添加到牛奶中，每个浓度5个平行样，按1.4方法提取后计算平均回收率和批内变异系数。
以最大残留限量浓度(0.1 mg／L)对空白牛奶进行添加，每次添加5个平行样，重复进行3个批次的试验，计算批间变异系数。
1．6 方法的检测限和定量限 分别按1.4的方法对空白牛奶以及添加不同浓度的牛奶样品进行测定，以特征碎片离子峰信噪比大于3为检测限，以特征碎片离子峰信噪比大于10为定量限。
2 结果
2．1 方法的线性范围 在0.05～0.5 mg／L的范围内，上霉素标准曲线为y＝0.035 6x+0．258 7，相关系数r=0.992 8；四环素标准曲线为у＝0.040 6x十O．338 1，相关系数r二0.993 4；金霉素标准曲线为у＝0.012 8一0.210 0，相关系数r＝0.994 9。
2．2 方法的准确度和精密度 根据1.5的方法操作，具体结果见表3。
2.3 方法的检测限和定量限 本法对土霉素、四环素和金霉素的检测限均为0.01mg/L.定量限均为0.025mg/L.。
3 讨论
3．1 四环素类药物的电喷雾质谱分析 四环素是两性物质，分子结构中同时含有酸性基团和碱性基团，电离时会同时产生正负离子，但是实验表明，正离子[M十H]+采集到的信号 较强，因此以正离子方式(ESl+)进行采集。在电喷雾电离方式下，四环素类药物产生的碎片离子主要是[M+H—NH3]+，[M+H-H2O]+和[M+H-NH3-H2O]+，同时根据欧盟理事会指令96／23／EC关于分析方法性能评价和结果解释的规定欧盟委员会决议2002／657／EC，以液相色谱—二级质诺连用作为确证方法只需要1个准分子离子峰及相应的2个碎片离于峰即可。另外，由于使用不同的锥孔电压和碰撞能量对于准分子离子峰和碎片离子峰的丰度有较大的影响．因此，作者综合考 虑以上因素，选择了3种四环素药物丰度相对较大的2个碎片离子进行试验，同时选出了最佳试验条件(表2)。
3．2 色谱条件的选择 比较了流动相中加与不加甲酸对于离子奉度的影响，结果表明流动相中加入甲酸能够相对增强离子丰度，因此本试验的流动相中加入了0.3％的甲酸以提高离子丰度。此外，由于采用等度洗脱不能将4种四环素类药物完全分离，故本试验采用梯度洗脱，并根据试验结果选择了适当的梯度洗脱程序(表1)。
本试验比较了甲醇、甲醇—水(不同比例)和水溶解四环素类药物的情况下对于灵敏度的影响，结果表明甲醇能明星降低方法的灵敏度。虽然仅用水作为溶剂溶解四环素类药物的灵敏度最高，但是考虑到四环素类药物在水中的稳定性较差，因此本试验综合考虑这2种因素。选择以甲醇—水(30：70)来溶解四环索类药物后进行LC／MS／MS分析。用以上条件进行试验，各组分的保留时间分别为；土霉素6.64mm，四环素8.14mm，去甲金霉素13.57min，金霉素16.51mmin。色谱图见图1和图2。
3．3 提取条件的确定 由于四环素类药物分子中含有酚羟基和烯醇基，容易与牛奶中的钙镁离子结合形成难溶的盐类，同时由于四环素类药物在酸性环境中较稳定，因此本试验采用酸性Mcllvaine—EDTA溶液进行提取，以竞争性拮抗四环素类药物与金属离子的结合，同时保证四环素类药物的稳定性，从而提高回收率。为了减少提取时间，选择5 mL溶液过C18小柱。此外，作者还比较了草酸甲醇与甲醇作为洗脱液对于试验结果的影响，结果表明2者没有显著差异。因此本试验选择甲醇作为洗脱液，而且甲醇的体积对于能否完全洗脱有重要影响，选择甲醇的适宜洗脱体积为2mL。由于四环京类药物遇热不稳定、易氧化，因此宜采用氮气吹干而不是旋转蒸发进行试验。另外，由于本方法的检测限和定量限已经能完全满足要求，故没有进行浓缩。如果有必要，可在本试验最后一步溶解时减少溶液的体积，以进一步提高方法的灵敏度。
3．4 方法的检测艰和回收率 由于本试验采用的信噪比是峰(特征离子峰)到峰(最大噪声峰)的信噪比，与通常所采用的选择较平稳的基线为分母来计算信噪比，其结果明显偏低，如果选用后一种方法计算信噪比并根据此信噪比确定方法的检测限和定量限，则本方法的定量限可达0.01 mg／L，甚至更在本试验条件下，3种药物在3个添加浓度的回收率为70.0％一87.6％，并且批内变异系数均不大于10％，而以最大残留限量浓度进行添加后所测得回收率的批间变异系数也都小于15％，这表明本方法具有良好的重复性．适于作为牛奶中四环索类药物残留的确证方法。