摘要 综述了国内外对喹喔啉1 ,4-二氧化物类兽药原料药及其在不同基质中的检测。检测方法主要有波谱法、色谱法、仪器联用技术和电化学法。
关键词 喹喔啉1 ,4-二氧化物;喹乙醇(olaquindox) ;卡巴氧(carbadox) ;痢菌净(mequindox) ;西吖氧(cyadox) ;检测
喹喔啉1 ,4-二氧化物类化合物( quindoxin) 是研究较早的具有抗菌活性的物质,在兽药领域运用的代表性药物有喹乙醇( olaquindox) 、卡巴氧[4] ( carbadox) 、西吖氧( cyadox)和痢菌净( mequindox) 等。痢菌净是我国研制开发的第1 个该类药物。这类药对畜禽有明显的促进生长和抗菌作用,能在动物体内参与蛋白的同化作用。这种蛋白同化作用的结果,促使更多的氮贮存,从而使畜禽生长更多的瘦肉。在提高畜禽对饲料的消化能力,促进生长发育,提高饲料的转化率方面也具有显著作用。此类药物的抗菌谱较广,对一些革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均有较强的抗菌作用,其抗菌的机理都是抑制DNA 合成。目前, 喹乙醇、卡巴氧、西吖氧等作为兽药与饲料添加剂在国内外应用非常广泛。喹乙醇主要在澳大利亚、巴西、日本及我国等应用,卡巴氧主要使用国家在美国和加拿大作猪饲料添加剂应用,而西吖氧的主要使用国家是捷克和斯洛伐克。近几年来,一些养殖户片面追求经济利益,滥用喹乙醇等喹喔啉二氧化物类饲料添加剂:超剂量使用或饲喂时间过长,甚至将其当营养添加剂来使用,从而引起畜禽蓄积性中毒。这类药残留在畜禽产品中,对人体造成较大危害。由中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所研制开发的我国一类新兽药喹烯酮也是属于这一类药。喹烯酮与喹乙醇等相比具有高效、安全、添加量少等优点,可明显提高畜禽繁殖率及幼仔畜禽的存活率。
国内外用于喹喔啉二氧化物类兽药检测方法主要有波谱法、色谱法、仪器联用技术和电化学法。由于该类药在不同的基质中含量不同,所选用的分析检测方法也有差异。
1 原料药的检测
属常量分析的范畴,中国兽药典2000 版[8] 收载了喹乙醇原料药的质量标准,英国药典80版收载了卡巴多原料药的质量标准,中华人民共和国兽药规范收载了痢菌净原料药的质量标准,分别从物理性状、定性鉴别、有关物质检查及含量测定都作了详细的规定,从而保证喹乙醇、卡巴氧和痢菌净原料药的质量。金录胜采用RP - HPLC方法测定我国一类新兽药喹烯酮及其制剂含量。以Symmetry C18柱为固定相,甲醇- 水(60∶40) 为流动相,检测波长314 nm ,喹烯酮在0. 05～0. 25 mg/ mL 浓度范围内呈线性关系(r =0. 999 3 ,n = 5) ,平均回收率99. 89 %,RSD 1. 13 %( n = 5) 。本法简便,快速,可用于其质量控制。Xiu - ShengMiao 等采用4 极杆飞行时间质谱定性研究卡巴氧、喹乙醇和其他喹喔啉氮氧化物。他们运用电喷雾电离方式获得这些氮氧化物的全扫描质谱图,研究表明在每个氮氧化物的全扫描质谱中存在相应的特征碎片离子[M+ H- O] + ,采用CID 源内诱导碰撞技术,改变锥孔电压确定碎片离子的元素组成。V raStará等采用吸附溶出伏安法对卡巴氧、西吖氧和喹乙醇进行分析测定。西吖氧、卡巴氧和喹乙醇的检测限分别为3×10 - 10mol/ L、2 ×10- 9mol/ L 和7 ×10 - 1 mol/ L。Ming - RenS. Fuh 等运用液相色谱- 电喷雾- 质谱法测定了喹乙醇、卡巴氧等13 种抗菌剂。他们采用C18 柱,梯度洗脱来分离13 种抗菌剂,质谱采用CID 源内诱导碰撞技术来分析化合物碎片和增强方法的专属性,运用SIM选择离子监测方式进行定量测定。本法检测限低,每种抗菌剂在0. 5～10 mg/ kg 范围内均具有很好的线性。
2 制剂中药物的检测
考虑到制剂中存在大量辅料,因此在建立检测方法时首先要排除辅料对药物的干扰,选用的检测方法主要以波谱法和色谱法为主。王文杰等应用近红外光谱分析技术快速检测预混剂中的喹乙醇。他们根据喹乙醇在畜禽饲料中的添加量通常在20～100 mg/ kg ,而预混料中的含量通常为5 %～10 %,为此研究设置了0. 5 %～20 %的含量范围的标样40个,梯度为0. 5 %,标样采用饲料级喹乙醇成品(粒度80 目)和稀释剂石粉(含碳酸钙98. 5 %以上,粒度100 目) ,按比例定量配制,在喹乙醇的1 645、1 708、l 986 及2 033 nm的4 个吸收峰值处对标样进行的NIRs 回归定标,建立定标方程,用15个检验样品检验4 对波长多元回归定标方程取得了较好的估测效果。苗小楼等采用紫外分光光度法测定我国一类新兽药喹烯酮预混剂中喹烯酮的含量,将喹烯酮溶解于40 %二氧六环中,由于基质不溶,过滤分离得喹烯酮,在312 nm 波长处测定吸收值,喹烯酮在2～12μg/ ml 范围内与吸收度呈良好的线性关系,标准曲线方程: y = 0. 068 0 x - 0. 003 1 ( r =0. 999 9) 。用喹烯酮对照品测得其预混剂的平均回收率为100. 1 %,RSD 为0. 32 %。检测制剂中痢菌净的文献报道也较多,如平星等采用紫外分光光度法中的单波长法和双波长法测定了复方制剂中痢菌净和甲氧苄胺嘧啶的含量。
由于痢菌净在386、242 和243. 2 nm 有最大吸收,而甲氧苄胺嘧啶在386 nm的波长处无吸收,因此在此波长下对痢菌净不造成测定干扰,可直接用单波长分光光度法测定。甲氧苄胺嘧啶在272 nm有稳定的最大吸收,但痢菌净在此处有干扰,此波长为测定波长Al ,以369 nm为参比波长A2 ,使得痢菌净在两波长处的有吸光度AA = A272 :2A369 = 0 ,可完全排除痢菌净的干扰。辅料基本无吸收。采用该法,痢菌净的浓度C 与吸光度A 的相关系数r 为0. 999 0 ,平均回收率为99. 2 %,变异系数为0. 44 %。为了促进动物的生长,将喹喔啉二氧化物类兽药(主要是喹乙醇) 制成中西复方制剂,对该类制剂中喹乙醇的测定文献报道较多,主要是高效液相色谱法、薄层色谱法、导数分光光度法和等吸收分光光度法。由于中药成分的复杂性,因此在检测时都首先进行了专属性考察以保证测定的准确性。
3 饲料中药物的检测
喹喔啉1 ,4-二氧化物类药物通常作为饲料添加剂使用,为了防止过量添加此类药物而引起对动物甚至人类的危害,检测其在饲料中的含量就显得尤为重要,这方面的研究报道较多。由于饲料中药物的分析属微量分析的范畴,对分析方法的灵敏度要求高。导数光谱在改善分析的选择性、提高灵敏度及消除背景干扰等方面具有独特的优点,因此周鸿志等研究使用导数分光光度法直接测定饲料中的喹乙醇的条件,饲料经蒸馏水提取喹乙醇后,直接以二阶导数光谱定量,提出喹乙醇二阶导数光谱扫描波长范围340～420 nm,实际样品测定时,以375～360 nm 区间的峰谷高度定量效果更佳。笔者用本法对多种饲料样品进行了测试,得到了满意的结果:方法回收率和相对标准偏差RSD 依次为98 %～104 %和3 %～0. 3 %。除此之外,国内对饲料中药物的检测以高效液相色谱法居多, 如欧阳华学等建立了高效液相色谱法测定饲料中喹乙醇含量的方法:饲料用甲醇- 水提取,在380 nm波长下检测,色谱柱为NOVA - PAK C18 (3. 9 mm ×150 mm,4 mm) ,流动相为甲醇- 水(体积比为10∶90) ,流速为1. 0 ml/ min ,喹乙醇质量浓度在2. 5～20. 0 mg/ ml 范围内与峰面积呈良好线性关系,相对标准偏差为1. 2 %～1. 6 %,回收率为97 %～101 %。国外在20 世纪70～80 年代就有这方面的文献报道。Fernando Jorge Dos Ramos 等采用柱色谱法同时测定猪饲料中的卡巴氧和喹乙醇,以四氯化碳- 二甲基甲酰胺(80∶20) 作溶剂提取药物,提取液中加入水并离心,取水层注入反相色谱柱中,采用梯度洗脱,紫外检测,分别选取波长306 和262 nm,在20～50 mg/ kg 水平下,卡巴氧的回收率达(92 ±9) %、喹乙醇的回收率为(93 ±6) %。SHIH -YUHLIN 等[40]运用液相色谱法同时测定饲料中的卡巴氧、喹乙醇、呋喃唑酮和硝基呋喃。本法采用C8 硅胶柱,以乙腈-水作流动相梯度洗脱,所有被测药物的线性回归曲线的相关系数均大于0. 999 ,在高中低3 种浓度下,4 次进样所得峰面积的相对标准偏差均小于3. 0 %。样品前处理时首先选用水作样品提取溶剂,后以95 %二甲基甲酰胺溶液室温下提取过夜,提取液用氧化铝柱净化。样品回收率都达90 %以上。
2001 年,国际上制定了饲料中卡巴氧的高效液相色谱检测方法,该方法的定量限为0. 5 mg/ kg ,检测限为0. 1 mg/ kg。近几年,由于接口技术的成熟,液质联用技术发展很快并已应用于饲料检测,C.Van Poucke 等[42]采用液质联用的方法测定了饲料中的喹乙醇的含量,既提高了灵敏度又提高了准确度,该方法的检测限小于0. 1 mg/ kg中国兽药114网。
4 药物残留的检测
除喹烯酮外,其他几种喹喔啉1 ,4-二氧化物类兽药都有一定的残留毒性,1999 年,欧共体禁止在动物饲料中使用包括喹乙醇、卡巴氧。为了保证人类的安全,国内外都相当重视这类药物的残留检测。残留检测与上述各类药物分析相比有其自身的特点:样品基质复杂,待测药物含量低和需要繁琐的样品前处理过程,属于复杂基质中痕量组分的分析技术。我国分别制定了出口肉中卡巴氧和喹乙醇残留检测的行业标准,标准规定了出口肉中卡巴氧和喹乙醇残留量检验的抽样、制样和液相色谱测定方法。标准适用于出口鸡肉、猪肉、羊肉、兔肉中卡巴氧和喹乙醇残留量的检验。农业部于2003 年1 月22 日发布第236 号公告,发布动物性食品中卡巴氧标示残留物检测方法———高效液相色谱法。本标准规定了动物性食品中卡巴氧的标示残留物喹喔啉-2-羧酸(QCA) 残留量检测的制样和高效液相色谱测定方法。本方法在猪的肌肉、肝脏和肾脏组织中的检测限为l5μg/ kg ,在l5μg/ kg 添加浓度下回收率为70 %～l10 %。标准适用于猪的肌肉、肝脏和肾脏组织中卡巴氧标示残留物残留量检测。
WHO/ FAO 在第36 和42 次食品添加剂大会上总结了卡巴氧和喹乙醇残留检测的方法[46 - 50] ,在这些方法中,C14 标记方法灵敏度高,但由于对实验操作者有一定辐射危害,目前已很少采用。随着分析仪器的发展特别是联用仪器的普及,对药物检测的灵敏度越来越高,因此在药物残留分析中,仪器分析联用技术已成趋势。M. M. L. Aerts 等[51]采用液相色谱在线预柱富集氢氧化钠柱后衍生化紫外检测的方法检测猪组织中的卡巴氧及其代谢产物。样品预处理采用甲醇- 乙腈作提取溶剂,用Florisil 柱净化,柱切换液相色谱系统进样分析,紫外检测波长选定为420 nm。该方法的灵敏度高,检测限范围在1～5 g/ kg ,平均回收率在81 %～87 %。G.M.Bin-nendijk 等也采用柱切换液相色谱柱后衍生的方法测定动物类产品中卡巴氧,卡巴氧的检测限为0. 5～1 g/ kg ,去氧卡巴氧的检测限为0. 5～2 g/ kg。肾、肌肉和肝中去氧卡巴氧的回收率达95 %,相对标准偏差为14 %,该法还可推广应用于血浆和蛋中卡巴氧的测定,肌肉、血浆及蛋中卡巴氧的回收率为70 %～80 %。Della W. M. Sin[53]将动物组织中卡巴氧的残留标示物喹喔啉222羧酸衍生化后进行气质联用测定,定量限可达0. 7μg/ kg(信噪比大于60) 。
5 小结
检测方法中,由于原料药中杂质相对较少,只要排除药物中间体和副产物的干扰,对原料药的检测波谱法和色谱法都可适用。在制剂及饲料中该类药物的分析中,主要考虑的是辅料和饲料基质对主药的干扰相对原料药分析来说,药物含量相对低,因此对方法的灵敏度检测限要求较高,一般以色谱法为主(特别是高效液相色谱法) 。导数分光光度法随着导数阶数的增加,灵敏度相对比分光光度法高,只要选择好适当的分析条件排除对主药的干扰,也不失为一种可行的方法。在药物残留检测与上述各类分析不同,残留分析的特殊性在于痕量、动态的药物存在于复杂的生物样品中,所以分离和检测是残留分析的两个基本方面,高分辨和高灵敏度是其发展的精髓。仪器联用技术特别是GC - MS 和LC/MS技术由于其集高效分离、高灵敏度和强有力的结构鉴定能力于一体,完全可以满足对药物残留检测所提出的低检测限的_要求。随着接口技术的不断改进和完,LC/MS 法在药物分析领域的优越性越来越被人们所认同,尤其是串联液相柱与串联质谱的出现,将会推动兽药分析方法的发展。（作者:张丽芳, 薛飞群 ）