(1)染色镜检
①抹片的制备
固体培养物(平板、斜面)或脓汁、粪便等抹片的制备：用接种环取生理盐水1滴，置于准备好的载玻片上，再用灭菌接种环取培养物少许混合于水滴中，混匀涂成薄膜，使其呈极轻微的乳浊为度，多余材料在火焰上灭菌。
液体培养物或血液、尿液、渗出液、乳汁等抹片的制备：直接用灭菌接种环取1环或数环待检材料，置于玻片上制成涂片。
组织、脏器材料触片的制备：取病料组织一小块，以其切面在玻片表面轻轻接触几次，注意不宜触重、过厚，任其自然干燥，即成组织触片(或称印片)。也可用其切面轻轻接触玻片表面并移动组织块制成抹片，自然干燥。
②干燥固定：抹片(触片)于室温自然干燥后，将涂抹面朝上，以其背面在酒精灯火焰上通过数次，略作加热(但不能太热，以不烫手背为度)进行固定。血液、组织、脏器等抹片(尤其作姬姆萨染色)常用甲醇固定，可将已干燥的抹片浸入含有甲醇的染色缸内，取出晾干，或在抹片上滴加数滴甲醇使其作用 3～5分钟后，自然干燥。
③染色：固定好的涂片或抹片即可进行染色。常规染色法有革兰氏染色法。基本过程是：染色→媒染→脱色→复染→干燥→镜检。
染色 在已干燥固定好的抹片上滴加草酸铵结晶紫溶液于涂、抹面上，染色2～3分钟，水洗。
媒染 滴加革兰氏碘液作用2～3分钟，水洗。
脱色 滴加95%酒精于抹片上，脱色时间应根据涂抹面的厚度灵活掌握，多在20～60秒之间，水洗。
复染 加稀释石炭酸复红溶液或沙黄水溶液数滴，染色1～2分钟，水洗。
干燥 吸水纸吸干或自然干燥。镜检 显微镜使用时应放置在便于采光(电光源显微镜除外)而平稳的实验桌或实验台上。尽量升高聚光器，放大光圈，调节反光镜，便射入镜头的光线最强。
于标本片的欲检部位，滴加香柏油1滴，将标本片固定于载物台正中，用油镜检查。首先眼睛从镜筒旁侧注视油镜头。小心转动粗调节器，使载玻片和镜筒靠近，直至油镜头浸没油中，几乎与玻片相接触，但不要碰到玻片。然后，一面从目镜观察，一面徐徐转动粗调节器使镜筒和载玻片的距离缓慢变远，待得到模糊物像时，再换用细调节器，直至物像完全清晰为止。此时，切勿用粗调节器使油镜头和载玻片靠近，以免压碎玻片，损坏油镜头。油镜用毕，应以擦镜纸拭去镜头上的香柏油。
革兰氏阳性菌染成蓝紫色，革兰氏阴性菌染成红色。
(2)划线分离
右手持接种环于酒精灯上烧灼灭菌，冷却后，无菌操作取病料，若为液体病料，可直接用灭菌的接种环取病料一环;若为固体病料，首先将烙刀在酒精灯上灭菌，并立即用其将病料表面烧烙灭菌，然后用灭菌接种环从烧烙部位伸到组织中取内部病料。
左手持平皿，用拇指、食指及中指将皿盖打开一侧(角度大小以能顺利划线为宜，但以角度小为佳，以免空气中细菌污染培养基)，将已取被检材料的接种环伸入平皿，并涂于培养基一侧，然后自涂抹处以腕力在平板表面轻轻地分区划线，可间断划线，也可连续划线，第一组作1～3次划线，环上的多余细菌材料烧掉后，从第一组划线引出第二组划线，接种环灭菌，再从第二组划线引出第三组划线，如此反复3～4组划线后，即可把整个平板表面划满。一组划线的起点只能与邻近的上一组划线重叠，这样就可在最后的1～2组划线上出现多量的单个菌落，以便进行纯培养。
划线完毕，烧灼接种环，将平皿盖好，用玻璃铅笔在平皿底部注明被检材料及日期，将平皿倒置于37℃温箱中，培养18～24小时后观察结果。
(3)纯培养
挑取可疑菌落进行染色、镜检，并将其同时接种在适宜的斜面上。
(4)生化实验
细菌都有各自的酶系统，因此，都有各自的分解与合成代谢产物，而这些产物就是鉴别细菌的依据。所谓细菌的生化试验，就是用生物化学的方法检查细菌的代谢产物。本试验的方法很多，常用的方法有：
糖发酵试验 将纯培养菌接种于各种糖培养基中，置37℃培养1～7天，多数细菌在24小时即可观察结果。产酸+(培养基变黄);产酸产气⊕(培养基变黄并有气泡产生);不分解-(培养基仍为蓝紫色)。
甲基红(MR)试验 将纯培养菌接种于葡萄糖蛋白胨液中，培养4～5天后，加甲基红试剂1～5滴于培养物5.0毫升中，呈红色者为甲基红试验阳性反应，黄色者为阴性反应。
V-P试验 取2～4天的葡萄糖蛋白胨培养物2.0毫升，先加6%α-萘酚酒精液1.0毫升，再加40%氢氧化钾液0.4毫升，充分摇动试管，在数分钟内出现红色者为阳性反应，如为阴性，应在37℃温箱中放置4小时再观察，若出现红色者为阳性反应，仍为无色者为阴性反应。
吲哚试验(靛基质试验) 取待测细菌接种在蛋白胨水中，置37℃温箱培养1～2天，向培养物中慢慢加入靛基质试剂0.5～1.0毫升，不要摇动，使其形成明显两层，即试剂重叠于培养物之上，注意观察培养物与试剂交接面上的变化，呈红色者为吲哚试验阳性，无变化者为阴性反应。
硫化氢试验 取细菌纯培养物穿刺接种于醋酸铅琼脂或三糖铁琼脂内，于37℃培养1～2天，如沿穿刺线有黑褐色者，即为硫化氢阳性反应。
枸橼酸盐利用试验 将细菌做成盐水悬液，接种1环于枸橼酸钠琼脂斜面上，置37℃培养4天，每天观察生长与否，阳性者有细菌生长，培养基从绿色转变为蓝色;阴性者不见有细菌生长，培养基仍为绿色。
根据可疑菌的生化特性接种各种生化培养基进行生化试验，观察其生化反应特性。必要时可进行血清学试验。
(5)动物致病性实验
将该菌的24小时肉汤培养物接种实验动物，观察数天可知其致病性。
(6)综合以上实验结果，即可确定病原菌的种类和名称。
