摘 要：猪细小病毒[/b]自发现日起，已广泛蔓延到世界各地，给养猪业造成了极大损失。为此许多学者对猪细小病毒[/b]进行了大量研究。此文就猪细小病毒[/b]诊断方法、防制措施等方面作一综述。
关键词：猪细小病毒[/b]；诊断方法；
防制措施
猪细小病毒[/b]病是由猪细小病毒[/b](ppv)感染而引起的胚胎感染及死亡，而母猪不表现明显症状的繁殖障碍性疾病。本病广泛分布于世界各地，给养猪业造成巨大的经济损失。引起该病的猪细小病毒[/b]是mary和mahnet于猪瘟病毒的组织培养时发现的。从20世纪60年代中期，分离病毒和逐步明确其致病作用以来，已相继从欧洲、美洲和亚洲等很多国家分离到该病毒和检测到抗体。我国在20世纪80年代初就有该病的报道，先后从上海、北京、吉林和黑龙江等地分离到该病毒，血清学调查阳性率为80%。猪细小病毒[/b]常与其他病原混合感染而致病。邬捷等（1987）报道了我国猪细小病毒[/b]与乙型脑炎病毒混合感染。目前又相继有人报道猪细小病毒[/b]和圆环病毒、繁殖与呼吸障碍综合征病毒(prrsv)混合感染的情况。正由于猪细小病毒[/b]感染面广且感染后造成严重的经济损失，许多学者进行了猪细小病毒[/b]诊断防治的研究，现综述如下。
1
猪细小病毒[/b]的诊断方法
1．1
分离鉴定
取70日龄以内流产胎儿、死产仔猪肾、睾丸、肺、肝、肠系膜淋巴结或母猪胎盘、阴道分泌物制成无菌悬液，接种细胞并培养，若病料中含有本病毒，16～36小时可观察到细胞核内包涵体，5～10天可见特征性细胞病变,再用血清学方法确诊。病毒分离和鉴定结果准确可靠，可以用作最后确诊。但费时费力，并且需要一定的技术条件和设备。
1.2
血清学检测
1.2.1 血凝(ha)和血凝抑制试验(hi)
血凝试验：该试验即使在死亡时间较长病毒无污染性的木乃伊胎中也可检出抗原。
血凝抑制试验：母猪感染后最早5天可检测到抗体，此后维持高滴度至少达4年。joo等（1976）建立了hi试验的标准方法，主要用于猪细小病毒[/b]感染后的抗体检测。韩孝成等(1996)、胡秀芳等(1989)、金岳等(1985)许多学者也对该方法进行了研究和探索。
ha-hi试验检测ppv抗体具有操作简便，不需要特殊设备等优点，因此国内一直使用ha-hi来检测抗原和抗体。但该方法需要采鸡或豚鼠血洗血球，必须对被检样品做繁杂的特殊处理，并只能证明有ppv感染，不能证明是否新近感染。虽能进行快速、大量的诊断，但是其灵敏度低、特异性不强，只能作为辅助诊断方法。
1.2.2
血清中和试验
可用于猪感染ppv后的抗体检测。johnsonhe等(1971)及joo等(1975)报道，经比较发现中和试验比hi试验敏感。该方法还可用于鉴定病毒和流行病学调查。中和试验操作较为复杂，首先要进行感染力的测定，低剂量不引起细胞病变，从而限制了该方法的使用。
1.2.3
对流免疫电泳 gaitamonova等(1990)首先采用对流免疫电泳技术实验室诊断ppv。我国王川庆（1996）也利用对流免疫电泳技术对猪细小病毒[/b]抗原和抗体进行了检测，与其他方法相比，对流免疫电泳的突出特点是简便、快速、稳定，且抗原血清不需要做任何特殊处理。
1.2.4
乳胶凝集试验
何启盖等（1999）建立了乳胶凝集试验来检测细小病毒的抗体。抗原与细小病毒阳性血清反应出现凝集颗粒(与其它病阳性血清、生理盐水不出现凝集现象)。乳胶凝集试验具有简便、准确的优点。目前该方法已应用于临床实践。
1.2.5
免疫荧光技术 rivera
等(1986)应用固相荧光免疫技术快速检测ppv感染胎儿的抗原和抗体，结果发现固相荧光免疫技术与elisa有相同的敏感性，而且比hi试验敏感。董齐等（1999）为了既提高检出率，又适于检验部门的应用，将ppv高免血清与胎儿组织中ppv抗原形成特异的反应，再加免疫猪igg
荧光抗体扩大抗原抗体反应的范围来提高检出率，建立了间接免疫荧光技术。该方法有特异、敏感、快速和检出率高等优点。
1.3
酶联免疫吸附试验（elisa）
hohdatsu等（1988）建立了细小病毒elisa。经比较证明，elisa检测ppv抗体与hi
试验的结果是一致的，可用于ppv抗体的检测。westenbrink等 （1989）应用竞争性elisa检测ppv抗体并与hi进行比较研究。jenkins
等（1992）将elisa应用于胎儿组织ppv抗原检测的研究，并与免疫荧光和hi试验比较。这些研究结果显示出elisa在特异性、敏感性和检测速度等方面优于免疫荧光和hi。
我国邱建明等（1989）建立了ppa-elisa法来测定母猪血清中抗细小病毒抗体。谢琴等（1996）研制出猪细小病毒[/b]单克隆抗体，并把已研制出的单克隆抗体采用elisa试验方法对当地308份血清进行了检测，结果阳性检出率达66.6%。elisa试验与传统的hi试验进行比较，其敏感性高，elisa阳性检出率为85.7%，而hi
阳性检出率为80%。单克隆抗体具有特异性强、效价高，并可在体外大量制备等优点，再配合灵敏性强的elisa试验方法是非常可行的，用此方法有助于ppv的早期诊断和流行病学调查。
在实践中，由于ppv疫苗的使用，很难区分免疫接种感染还是自然感染，所以仅凭检测抗体很难确诊，必须建立检测抗原的方法。
姜永厚等（1997）建立了从胎猪脏器中检测猪细小病毒[/b]抗原的elisa双抗夹心法。张晓根等（1994）研究出间接dot-elisa用于检测ppv抗原。
1.4
银加胶体金技术
黄瑜等（1995）首次成功研制了检测细小病毒抗原的银加胶体金检测法，并确定了最佳试验条件。应用该法对纯化ppv抗原的最小检出量为0.312
5
mg/点。其敏感性为间接dot-elisa和ha的8倍和100倍。20份样本用本法检测结果与病毒分离鉴定结果完全相符。曹三杰(1999)也应用胶体金染色法检测猪细小病毒[/b]抗体的研究。
1.5
分子生物学诊断法
1.5.1 pcr反应
molitor等(1991)最先报道了pcr在检测ppv上的应用，根据nadl-8和nadl-2碱基序列设计合成了一对20个碱基的引物和寡聚核苷酸探针，上下引物相隔118个核苷酸，用此引物分别对ppv的nadl-8、nadl-2、kbsh和kresse株以及cpv、rpv进行了扩增证明引物的特异性。该方法能检出100
fg的rf dna，相当于1 pfu的病毒感染量。我国沈冰等（1993）、李文刚等（1996）也采用pcr对猪细小病毒[/b]进行研究。王汉中等（1996）应用两对引物对ppv进行套式pcr反应体外扩增。由于ppv常与其他病毒混合感染，赵俊龙等（2002）在已建立的单项ppv和prv基础上通过扩增条件的筛选，建立了检测ppv和prv的复合pcr诊断方法，并用于临床。利用一次pcr反应即可同时扩增ppv
445 bp 和prv 217 bp特异性片段。
1.5.2 核酸探针
koromyslov等（1988）报道同位素标记的dna探针，能检出细胞培养物中一个血凝单位的猪细小病毒[/b]，也能检出试验感染ppv母猪干尸化胎儿内脏悬液中的ppv。同年krell等、oraveerakul等(1990)报道利用非放射性元素标记dna对
ppv进行检测，我国侯喜林等(1997)、吴保成等（1992也进行了这方面的研究。也有人把pcr和分子杂交结合起来进行ppv的检测。amauld
等(1998)在vp2选择引物进行扩增，再在微孔盘上与光生物素标记探针杂交，结果用比色法确定。该方法能检测出20 mg肺样品中的6 fg rf
dna。
综上所述，猪细小病毒[/b]的诊断方法很多，但临床上应用最多的是血凝和血凝抑制试验，这两种方法可用于血清流行病学的检测和抗原的检测，但要得到确诊还是需要病毒的分离鉴定。核酸探针杂交和pcr检测技术，具有高特异性和高灵敏度，引物和探针可大量合成长期保存，检测速度快，结果可靠，同时还可避免散毒。虽然这些方法在临床应用上还存在一定的困难，但具有很好的应用前景。
2
猪细小病毒[/b]的防制措施
2.1
疫苗
2.1.1 弱毒苗 最早发现和应用于临床的是ppv
nadl-2弱毒株，该毒株是将ppv强毒在实验室利用细胞培养连续传代50次以上致弱的。临床试验证实，血清学阴性的妊娠母猪口服或鼻内接种nadl-2株，尽管有病毒血症存在，却不引起胎儿感染；若将该毒株经子宫内接种，可引起胎儿感染，从而导致繁殖障碍。fujisaki等（1982）将ppv野毒ppv
90hs在猪肾细胞上低温(30
℃)连续传54代，产生ht弱毒株，该毒株接种猪后不产生病毒血症，但能诱导产生高滴度的抗体和较强的免疫力。在此基础上，akihiro等(1986)将ht株在猪肾细胞上培养并用紫外线照射后传代，获得了安全性更好的ht-sk-c株，利用该毒株生产的弱毒疫苗已在日本商品化。蒋玉雯等（1992）从广西初产母猪所产死胎脏器中，分离出一株ppv自然弱毒株n株。用该毒株接种ppv
hi抗体阴性的4月龄猪和怀孕14～23天的后备母猪,结果不产生病毒血症、同居感染，母猪分娩正常，所产仔猪吃奶前hi抗体阴性。另外，免疫的妊娠母猪，用强毒攻击后49天剖杀，胎儿发育正常，胎心采血hi抗体阴性，取胎儿脏器进行组织培养也未分离到病毒，而对照猪攻毒后产生了病毒血症并导致繁殖障碍。叶向阳等（1996）将通过st细胞连续传代获得弱毒株，经安全性试验证实该毒株有良好的安全性及其制成的疫苗有良好的免疫性。尽管在临床上已有多株弱毒疫苗应用，但是由于ppv强毒株的大量存在，人们对病毒重组及弱毒返强的担心一直使弱毒苗的应用受到一定限制。
2.1.2
灭活苗
1)单价灭活苗
自1976年国外就有关于ppv灭活疫苗的研究报道，并于20世纪80年代在美国、澳大利亚、法国等国家普遍应用。我国潘雪珠等（1987）首先成功研制了ppv灭活疫苗，之后，王润之等（1989）、邬捷等（1989）、韩孝成等（2001）、肖驰等（2000）、吕建强等、叶向阳等（2002）也先后研制出ppv灭活疫苗。徐涤平等（1995）采用幼龄猪增殖ppv，并以蜂胶作为ppv感染症灭活疫苗的佐剂。经一系列试验和实际应用表明，以蜂胶作佐剂制备的ppv灭活疫苗有安全、使用方便、易于保存等优点。能刺激动物产生高滴度抗体和显著的免疫保护效果。
ppv灭活疫苗的研制中，应用的灭活剂有福尔马林、β-丙内酯(β-pl)、aei[/b](n-乙酰乙烯亚胺)以及bei(二乙烯亚胺)等。fujtsakui用福尔马林灭活病毒制成的疫苗，诱导免疫动物产生了较高滴度的抗体，但保护效果不理想；潘雪珠等(1998)比较了福尔马林和aei[/b]的灭活效果，证实aei[/b]优于福尔马林；joo等(1977)用β-丙内酯灭活的疫苗，可使猪产生的抗体至少持续4个月以上。免疫佐剂是影响ppv灭活疫苗效果的重要因素。
molitor等(1985)比较了13种不同佐剂用于ppv灭活疫苗的效果，结果发现50％氢氧化铝胶、顺丁烯乙酰(ema)、cp-20961(avridin)、油水乳剂及dimethyl-dioctadecyl-ammonium
bromide(dda)作佐剂的疫苗，均诱导猪产生了高滴度的抗体，而用油佐剂、sds、l-121、氢氧化铝和油乳剂混合物、sds和氢氧化铝混合物作佐剂的疫苗产生的抗体滴度均较低。目前在ppv灭活苗的制备中，经常采用的佐剂是氢氧化铝和油水乳剂。
2)二联苗研究
细小病毒常与伪狂犬病毒(prv)、流行性乙型脑炎病毒(jev)等引起繁殖障碍的病毒混合感染，研制出灭活多联疫苗可以简化免疫程序，降低临床应激反应，适合规模化养猪业的发展趋势。ide-s等(1977)首先报道ppv和jev两种的共同免疫研究，产生的ppv和jev抗体水平分别与相应单苗的相同。men-geling等将通过细胞培养增殖的ppv和prv，用aei[/b]在37
℃灭活后混合，加入10％的al(oh)3制成灭活二联疫苗用于免疫预防试验。16头后备母猪进行两次免疫，间隔期为2周，8头母猪在妊娠后9周用prv攻击，8头母猪在妊娠后6周用ppv攻击，然后分别在第13周和12周宰杀，观察保护情况。结果发现，16头母猪均未发生繁殖障碍，从胎儿体内未检出prv和ppv。对免疫母猪的血清学检测结果证实，经二次免疫后，母猪的prv中和抗体和ppv
hi抗体滴度,与采用单苗免疫的抗体水平相当或稍高。从而说明,prv-ppv灭活二联疫苗具有良好的免疫保护作用。1986年，邬捷等在国内首次报道用ppv苗和jev苗共同免疫成功，并获得明显效果，死仔率下降至10.77%～0%。1989年，邬捷等用ppv灭活苗与jev灭活苗混合或同时免疫后备母猪均取得了满意的效果。姜天童等(1996)利用幼龄胎猪生产ppv,利用小鼠增殖jev后，分别灭活后制成灭活二联疫苗，通过二联苗和单联苗比较试验显示，二联苗与两种单苗免疫猪产生的ppv和jev抗体水平无显著差异。以上试验均证实两种病毒抗原同时刺激机体没有相互干扰作用。
2.1.3
新型疫苗
弱毒疫苗有免疫原性好，免疫后产生抗体快，且免疫维持时间较长等优点，但由于弱毒疫苗存在返强的危险，使得弱毒苗在应用上存在一些限制。现在常用灭活疫苗，但由于灭活疫苗产生抗体时间较长，产生效果不稳定等原因，所以寻找和发现安全有效的疫苗仍是目前研究的主题。
细小病毒vp2基因是细小病毒主要的衣壳蛋白，并能自我装配成类病毒粒子，可能成为研究的主要方向。martlnez等(1992)将ppv
vp2基因克隆到杆状病毒表达系统中，并成功地在昆虫细胞中高效表达，表达的vp2多肽能自我装配成类病毒粒子(virus-like
particles，vlps)。用其接种母猪能诱导产生免疫应答。赵俊龙等进行了有关ppv核酸疫苗的研究，动物试验初步表明，以ppv结构基因vpl和vp2分别构建的核酸疫苗，均能诱导产生较高水平的体液免疫和细胞免疫，比常规灭活疫苗产生的高。
2.2
综合防制措施
2.2.1
免疫接种。我国普遍使用的是灭活疫苗，初产母猪和后备公猪，在配种前一个月免疫注射。
2.2.2
坚持自繁自养，杜绝引进病猪和带毒猪。如需要引进种猪必须从无ppv感染猪场引进，引进种猪时，进行猪细小病毒[/b]的血凝抑制试验后，当hi滴度在1∶256以下或阴性时，才能引进。
2.2.3 加强预防性卫生措施，改善猪场环境，彻底消毒，限制人、猪的流动。
2.2.4
污染猪场还要加强检疫。病猪、健康猪分开饲养，健康猪接种疫苗，患猪的排泄物、污染物及死胎和胎衣妥善处理。
