青霉素阻抑粘肽合成，造成细胞壁缺损。由于敏感菌菌体内渗透压高，使水分不断内渗，以致菌体膨胀，促使细菌裂解、死亡。
【抗菌作用】
青霉素作为杀菌药，主要作用于大多数革兰阳性菌、革兰阴性球菌、螺旋体和放线菌。敏感菌主要有：溶血性链球菌、肺炎链球菌、草绿色链球菌、脑膜炎奈瑟菌、白喉棒状杆菌、炭疽芽孢杆菌及不产酶的金葡菌和表葡菌；厌氧菌中的产气荚膜芽胞梭菌、破伤风芽胞梭菌等；梅毒螺旋体、钩端螺旋体及放线菌等。对淋病奈瑟菌敏感性较差，对阿米巴原虫、立克次体、真菌、病毒无效。
青霉素的杀菌作用特点为：①对革兰阳性菌作用强，对革兰阴性菌作用弱；②对繁殖期细菌有作用，对静止期细菌无作用；③因为哺乳类动物和真菌细胞无细胞壁，故青霉素对人毒性小，对真菌无效。
【临床应用】
1.革兰阳性球菌感染 如溶血性链球菌、肺炎链球菌、敏感葡萄球菌等革兰阳性球菌感染；草绿色链球菌引起的心内膜炎也属首选。
2.革兰阳性杆菌感染 对气性坏疽、破伤风、白喉应配合相应的抗毒素。
3.螺旋体感染 治疗梅毒的首选药，大剂量应用；治疗钩端螺旋体病必须早期使用。
4.敏感菌引起的脑膜炎 脑膜炎奈瑟菌、肺炎克氏菌、肺炎链球菌等引起的脑膜炎。
5.淋病奈瑟菌感染 近来耐药菌株增多 ，需根据药敏试验确定是否可用。
6.放线菌感染 治疗宜大剂量、长疗程，必要时需作外科引流或切开感染灶。
