生产鸡痘细胞苗一直以来都是在细胞中加入适量犊牛血清的培养液进行培养，但是由于犊牛血清中广泛性的存在牛黏膜病的病毒抗体，给鸡痘细胞苗的生产带来了很大的困难。为了排除该病毒抗体的干扰，顺利而稳定地生产鸡痘细胞苗，因此笔者应用小牛血清代替犊牛血清生产鸡痘细胞苗的试验。最后测得两种细胞苗的效价基本相等，从而可以得出利用小牛血清代替犊牛血清生产鸡痘细胞苗是可行的。
一、试验材料
（一）供试血清的制备
1．收集外观健康的犊牛置于清洁的试验场地进行人工喂养，3月龄时逐头采集血样，提取血清送检。
2．逐头采集牛黏膜病抗体阴性的犊牛血清，提取血清分别放量，采血间隔时间为10天，采血量视小牛体质及月龄而定，同时每隔一定时间将血清提样送检，当小牛饲养至8月龄时一次性剖杀，提取血清，样品送检。
3．将送检样品前、中、后牛黏膜病抗体检查均合格的血清均匀混合，过滤除菌，即得多头份混合的合格的供试血清。
（二）常用玻璃器皿及其它器械
量筒（1000毫升、500毫升、250毫升、100毫升、50毫升）各一个；培养皿10个；烧杯（1000毫升、500毫升、200毫升、100毫升、50毫升）各一个，一次性注射器（5毫升）10个；灭菌剪刀；镊子；报纸；纱布；棉线；可视瓶（25毫升）10个；小滤膜0.2μm；玻璃棒两根；移液管（10毫升、5毫升）共10根；移液枪（0.1～0.5μm、10～200μm）
（三）试验动物
9～11日龄的SPF鸡胚（由山西隆克尔生物制药公司提供）
（四）细胞培养液的制备
7.5％NaHCO3溶液 NaHCO3 7.5克，双蒸水（高压）100毫升，用0.2微米滤膜过滤除菌，分装于小瓶中冷藏待用。
分别溶于水中过滤，然后混合在一起补足双蒸水至10毫升，加2毫升氯仿，2～8 ℃保存，使用时，用双蒸水稀释10倍，经116℃灭菌15分钟，使用前，以7.5％NaHCO3调PH为7.2～7.4。
0.4%胰蛋白酶溶液（细胞分散液） 胰酶＋Hanks液，比例为：1克胰酶／25毫升，放冰箱2～8℃保存过夜，待胰酶充分溶解后，用0.2微米的微孔滤膜过滤除菌，分装于小瓶中，－20 ℃保存。
0.5％乳汉液（营养液） 水解乳蛋白0.5克，Hanks液100毫升，完全溶解后分装，经116℃灭菌15分钟，2～8℃备用，使用时须加入适量犊牛血清。
75％的酒精棉 75毫升无水乙醇＋25毫升无菌水＋脱脂棉
双抗的制备 青霉素160万单位/毫升，链霉素80万单位/毫升，双蒸水100 毫升。
注：用时要求乳汉液中的双抗为100～150单位/毫升。
二、试验步骤
选择9～11日龄发育良好的SPF鸡胚，先用碘酒棉再用酒精棉消毒鸡胚气室部位，无菌取出鸡胚，然后去头、四肢和内脏，放入灭菌的玻璃平皿内，用汉氏液洗涤鸡胚；
用灭菌剪刀剪成米粒大小的组织块，再用汉氏液洗2～3次，然后加0.4%的胰酶（每个鸡胚大约加4毫升）；
在37.5～38.5℃的水浴锅内消化20～30分钟，然后吸出胰酶溶液；
用汉克氏液洗2～3次，然后将其分装于甲、乙两个器皿中；
往甲中加入含5%～10%犊牛血清乳汉液，加适宜的抗生素，PH为7.2～7.4。往乙中加入用含5%～10%小牛血清乳汉液，同样加适宜双抗，PH7.2～7.4，都反复吹打。
分别用8层纱布过滤，制成每毫升含活细胞约100～150万的细胞悬浮液，分装于可视瓶内（加入量为可视瓶容量的10%），放入CO2培养箱中37℃培养，形成单层24小时后接毒；
稀释种毒到适当比例，24小时后接种于甲、乙两种细胞中，培养至75%的细胞被感染；
将甲、乙两种接毒后的液体进行收获（即将甲、乙两液分别装于容器内，然后反复冻融）；
选两个9～11日龄的鸡胚，用照蛋箱将鸡蛋的气室轮廓描出来，在A、B两点分别扎孔（B点应尽量避开大血管），然后在A点抽真空，便会在B点形成如人工气室，接着将A点用蜡封住。用甲、乙两种收获液分别从B点给甲、乙两只鸡胚接毒，后将B点用蜡封住．孵化5天即120小时后观察结果。
三、结果
（一）接毒前后的鸡胚成纤维细胞
1．接毒前的鸡胚成纤维细胞
图2 接毒前的鸡胚成纤维细胞
2．接毒后的鸡胚成纤维细胞
图3 接毒后的鸡胚成纤维细胞
(二)培养5天后的观察结果
将两种鸡蛋都通过人工气室的方法接毒，然后分别观察细胞毒液和细胞维持液的感染情况（表2、表3）。
四、分析和讨论
1．倒置显微镜观察，接毒前细胞在可视瓶呈棱形或不规则三角形生长，细胞中央由卵圆形核，接毒后，细胞轮廓会增强，反差增大，胞质中时而出现颗粒、圆形、脱滴和腔泡等现象（图1、图2）。
2．5天后分别观察两种鸡蛋，通过分别观察两种鸡蛋的毒液和维持液的感染情况，得出两种鸡蛋的感染情况基本相同
3．从观察结果可看出，用小牛血清和犊牛血清加入乳汉液中培养出来的鸡痘细胞苗效价是一样的。所以，用小牛血清代替犊牛血清生产鸡痘细胞苗是可行的。
4．细胞系统对营养的需求并不十分苛刻，小牛血清中的成分足以提供其生长发育的因子，同时也可预见该细胞系统对人工培养基也能较好的适应。
5．在试验中用胰酶消化组织块时一定要多次，即先将胰酶加入到组织块容器内，剧烈振荡，然后静置，将上清液倒入一个容器内，再次往组织块内加入酶液消化。如此反复消化多次让液体中含更多的鸡胚成纤维细胞。
6．不同批号的血清往往体外培养细胞成功与否常取决于所选用血清质量，而且不同批号的血清往往有个体差异,质量不尽一样，细胞长势差别很大，所以在培养细胞之前必须对使用的血清进行质量鉴定。
应用小牛血清代替犊牛血清生产鸡痘细胞苗的研究试验
（作者:袁建琴 高斌战）
